劉亞舉 ，郭利紅 ，李 瑾，岳俊濤 ，石美森

（1.許昌市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南 許昌 461000；2.河南省公安廳刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南鄭州 450003；3.中國(guó)政法大學(xué) 證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088）

Y染色體短串聯(lián)重復(fù)序列（Y-chromosome short tandem repeats，Y-STR）在減數(shù)分裂過程中不發(fā)生重組，呈穩(wěn)定的單倍型父系遺傳，且序列的改變僅僅是由突變引起，較常染色體STR基因座具有顯著的人群及地域分布特征。因此，選擇多個(gè)Y-STR基因座構(gòu)建合適的復(fù)合擴(kuò)增體系，探討其單倍型在不同人群中的分布規(guī)律，在人類的起源進(jìn)化、群體劃分、種族民族差異和法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等研究中具有極其重要的意義。

STRtyper-27Y擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒（寧波海爾施基因科技有限公司）的27個(gè)Y-STR基因座能夠區(qū)分來源于多群體不同家系男性之間的父系親屬關(guān)系，可以增加近親男性的個(gè)體識(shí)別度[1-4]。本研究采用STRtyper-27Y擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒[5-9]對(duì)甘肅東鄉(xiāng)族男性人群中的遺傳多態(tài)性進(jìn)行調(diào)查，旨在為個(gè)體識(shí)別和父權(quán)鑒定提供基礎(chǔ)群體數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

根據(jù)知情同意原則，從健康體檢人群中隨機(jī)采集526名甘肅省臨夏回族自治州東鄉(xiāng)族自治縣東鄉(xiāng)族無(wú)關(guān)男性個(gè)體外周血0.1mL，滴入采血卡（武漢驥騰公司），陰干后常溫保存。該研究得到相關(guān)道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

通過YHRD數(shù)據(jù)庫(kù)（www.yhrd.org）獲得中國(guó)漢族（YA004092）、河南漢族（YA004057）、廣東漢族（YA004066）、甘肅藏族（YA004043）、丹麥（YA003283）、德 國(guó) （YA003473）、意 大 利 （YA003983）、西 班 牙（YA003147）、波蘭（YA003124）、瑞士（YA003269）、美國(guó)亞洲裔（YA004084）、美國(guó)拉美裔（YA004086）、美國(guó)歐洲裔（YA004085）、美國(guó)非洲裔（YA004083）共14個(gè)群體的27個(gè)Y-STR基因座（DYS576、DYS389Ⅰ、DYS635、DYS389Ⅱ、DYS627、DYS460、DYS458、DYS19、GATA_H4、DYS448、DYS391、DYS456、DYS390、DYS438、DYS392、DYS518、DYS570、DYS437、DYS385a/b、DYS449、DYS393、DYS439、DYS481、DYF387S1a/b、DYS533）單倍型分布數(shù)據(jù)（共 6 322 個(gè)單倍型）。

1.2 方法

根據(jù)STRtyper-27Y擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒說明書，用直接擴(kuò)增法（免提?。?duì)前述血樣（1.2 mm直徑血卡）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在9700型PCR儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）上進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 10 μL，其中 PCR Master Mix 5.0 μL、Primer Mix 2.5μL、純水 2.5μL。 PCR 條件：95℃ 5min；94℃ 10s，61℃ 1 min，70℃ 30 s，28 個(gè)循環(huán)；60℃ 20 min；4℃保溫。取1μL擴(kuò)增產(chǎn)物與0.5μL熒光標(biāo)記內(nèi)標(biāo)SIZE-500 Plus和8.5μL去離子甲酰胺混合，95℃變性3min后，冰浴3min，置3500xL基因分析儀（美國(guó)AB公司）上全自動(dòng)毛細(xì)管電泳，Data Collection軟件收集數(shù)據(jù)，用GeneMapper?ID-X v1.4軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行等位基因分型。每批樣本檢測(cè)均采用007和超純水分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用直接計(jì)數(shù)法對(duì)各基因座的等位基因頻率和單倍型檢出頻率進(jìn)行計(jì)算。基因多樣性（gene diversity，GD）和單倍型多樣性（haplotype diversity，HD）采用公式：

其中Pi為等位基因或單倍型頻率，n為樣本數(shù)。利用YHRD數(shù)據(jù)庫(kù)提供的在線工具（http://www.yhrd.org/Analyse/AMOVA）進(jìn)行分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA），計(jì)算臨夏回族自治州東鄉(xiāng)族自治縣東鄉(xiāng)族無(wú)關(guān)男性群體與其他14個(gè)群體間的遺傳距離（Rst值），并構(gòu)建多維尺度分析圖（multidimensional scaling，MDS）。

2 結(jié) 果

2.1 甘肅東鄉(xiāng)族人群27個(gè)Y-STR基因座遺傳多態(tài)性

27個(gè)Y-STR基因座在526名甘肅東鄉(xiāng)族無(wú)關(guān)男性個(gè)體中均得到了有效擴(kuò)增，且各基因座間擴(kuò)增產(chǎn)物平衡，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在100～500bp。27個(gè)Y-STR基因座的等位基因頻率見表1。在23個(gè)單拷貝基因座中共檢測(cè)到196個(gè)等位基因，各基因座分別檢出4～16個(gè)等位基因，等位基因頻率為0.001 9～0.707 2，在DYS448、DYS533、DYS19、GATA_H4、DYS456、DYS570基因座觀察到了等位基因缺失現(xiàn)象。雙拷貝基因座DYS385a/b共觀察到17個(gè)等位基因，55種單倍型；DYF387S1a/b檢出10個(gè)等位基因，39種單倍型。

27個(gè)Y-STR基因座共檢出471種單倍型，累積GD值達(dá)0.9995，詳見表2，其中GD值最低為DYS391（0.4539），最高為 DYS385a/b（0.9575）。7 個(gè)快速突變基因座（DYS576、DYS627、DYS570、DYS518、DYS449、DYF387S1a/b）的GD值均在0.7以上。

2.2 甘肅東鄉(xiāng)族與參考群體間的遺傳距離及MDS分析

應(yīng)用本研究甘肅東鄉(xiāng)族人群27個(gè)Y-STR基因座單倍型數(shù)據(jù)，計(jì)算與YHRD數(shù)據(jù)庫(kù)中其他14個(gè)群體相同基因座的遺傳距離（表3）。結(jié)果表明，甘肅東鄉(xiāng)族與其他14個(gè)群體之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在亞洲群體中，甘肅東鄉(xiāng)族與甘肅藏族之間的遺傳距離最近（0.068 2），其次是與廣東漢族（0.073 4）、美國(guó)亞洲裔（0.063 0）之間的遺傳距離較近，與河南漢族之間的遺傳距離相對(duì)最遠(yuǎn)（0.084 7）?；谶z傳距離所構(gòu)建的MDS基本與之相符，其中甘肅東鄉(xiāng)族和甘肅藏族群體聚為一大類（圖1）。

表1 27個(gè)Y-STR基因座的等位基因頻率 （n=526）

表1（續(xù)）

表2 27個(gè)Y-STR基因座的GD值 （n=526）

國(guó)美 國(guó)美裔美拉 裔洲歐＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋1 0.025國(guó)美裔洲亞＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋5 0.178 9 0.095）值ts R是下線角對(duì)，值P的應(yīng)對(duì)是上線角對(duì)（陣矩離距傳遺值ts R體群個(gè)41他其與族鄉(xiāng)東肅甘3表國(guó)美裔洲非＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋5 0.170 9 0.249 4 0.159人士瑞＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋3 0.197 8 0.155 2 0.008 6 0.020人牙班西 人蘭波 人利大意 人國(guó)德 人麥丹肅族甘藏＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－1 0.134＋＋＋0 0.007 5 0.113＋ ＋9 0.053 1 0.049 5 0.120＋9 0.175 4 0.057 6 0.109 4 0.150 7 0.250 5 0.047 8 0.094 2 0.099 8 0.177 1 0.036 8 0.194 4 0.031 6 0.043 1 0.027 2 0.154 1 0.264 1 0.212 1 0.154 8 0.167 2 0.167 9 0.154 2 0.168 9 0.230 5 0.094 4 0.147 6 0.170 0 0.086 3 0.012 4 0.227 9 0.038 5 0.066 4 0.056 5 0.189 8 0.031 2 0.178 8 0.008 0 0.051 4 0.048 9 0.125南河 東廣族漢 族漢＋ ＋＋ ＋＋5 0.022 8 0.083 3 0.091 5 0.187 3 0.181 9 0.165 8 0.165 6 0.117 6 0.114 0 0.220 3 0.231 0 0.175 6 0.185 2 0.185 4 0.173 3 0.202 2 0.173 2 0.023 4 0.007 6 0.191 9 0.192 9 0.128 6 0.118國(guó)中族漢＋0 0.010 3 0.010 9 0.091 6 0.183 1 0.166 6 0.112 2 0.237 0 0.177 9 0.174 9 0.202 1 0.012 3 0.185 0 0.121肅甘族鄉(xiāng)東族3 0.077 4 0.073 7 0.084 2 0.068 7 0.065 9 0.044 6 0.052 5 0.089 7 0.131 0 0.093 6 0.119裔0 0.063裔5 0.121裔5 0.067裔0.05

3 討 論

本研究中，27個(gè)Y-STR基因座共檢出471種單倍型，累積GD值達(dá)0.9995。其中檢出單倍型最多的是DYS385a/b基因座（55種），DYF387S1a/b基因座次之（39種），其余23個(gè)單拷貝基因座中共檢測(cè)到196個(gè)等位基因，各基因座分別檢出4～16個(gè)等位基因。結(jié)果表明，27個(gè)Y-STR基因座可用于家系排查及數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)。

遺傳距離為表示群體間或物種間遺傳差異或遺傳分化的最重要參數(shù)，是以兩個(gè)群體間同一座位上相同等位基因頻率差異的函數(shù)為測(cè)定依據(jù)的。本研究構(gòu)建的Rst遺傳距離矩陣顯示，甘肅東鄉(xiāng)族與甘肅藏族之間的遺傳距離最近。從MDS的散點(diǎn)圖結(jié)果可以看出，15個(gè)群體大致可以劃分為4個(gè)類群：第一類群，甘肅東鄉(xiāng)族、甘肅藏族、美國(guó)非洲裔；第二類群，中國(guó)漢族、廣東漢族、河南漢族、美國(guó)亞洲裔；第三類群，丹麥、德國(guó)、波蘭；第四類群，西班牙、美國(guó)歐洲裔、美國(guó)拉美裔、意大利、瑞士。大體上看，27個(gè)Y-STR基因座組成的單倍型計(jì)算的遺傳距離結(jié)果與各參考群體地域分布較一致[10]，表明Y染色體遺傳標(biāo)記在種族、民族群體間遺傳距離和基因漂流的評(píng)價(jià)中起到了重要作用。

綜上，本研究獲得了甘肅東鄉(xiāng)族群體27個(gè)Y-STR基因座的等位基因頻率及單倍型分布數(shù)據(jù)，為建立甘肅東鄉(xiāng)族群體Y-STR分布數(shù)據(jù)庫(kù)、該地區(qū)法醫(yī)學(xué)應(yīng)用及遺傳關(guān)系的分析提供了良好的遺傳背景數(shù)據(jù)。