洪璇，陳仲巍，李鶴賓，楊丙曄，羅浩虹，林啟凰

（廈門醫(yī)學(xué)院廈門市海洋醫(yī)用天然產(chǎn)物與細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361023）

雞桑（Morus australis）是桑科，桑屬小喬木或灌木，在我國(guó)的大部分省份均有分布，雞桑在我國(guó)具有數(shù)千年的種植歷史，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]。雞桑營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體必需的生物堿、維生素、氨基酸、多糖和黃酮等多種天然有效成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗衰老、降血壓、降血糖、降血脂等多種生理功能[2-3]。其中多糖是自然界中動(dòng)植物等生物體內(nèi)具有某種特殊生物學(xué)功能的高分子碳水化合物，具有預(yù)防動(dòng)脈硬化、延緩衰老、抗腫瘤﹑抗炎、抗氧化等多種生理活性[4-5]。但由于對(duì)雞桑研究及加工技術(shù)的缺乏，經(jīng)濟(jì)價(jià)值一直沒(méi)有得到充分的體現(xiàn)。本文對(duì)雞桑葉多糖進(jìn)行提取，并對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)雞桑葉為天然食品抗氧化劑和天然藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞桑葉：采于廈門市同安區(qū)五顯鎮(zhèn)；乙醇（食用級(jí)）：浙江共輝食品科技有限公司；其它試劑均為分析純。

UV-1800PC-DS2型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司生產(chǎn)的；KQ-100DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝

將采摘的雞桑葉浸泡于蒸餾水，洗凈，自然晾干，并于50℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥，粉碎，取60目～80目的粉末，備用。稱取一定量備用的雞桑葉，加入無(wú)水乙醇進(jìn)行浸泡，過(guò)濾，得濾渣，將石油醚加入到濾渣中進(jìn)行脫脂脫色，過(guò)濾并干燥得濾渣。將濾渣加入到燒瓶中，按照所考察的因素及條件進(jìn)行回流。操作工藝結(jié)束后，加入Sevag試劑進(jìn)行震蕩，靜置分液除去有機(jī)層，后過(guò)濾得濾液，將濾液進(jìn)行濃縮后在容量并中定容。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定

按文獻(xiàn)[6]方法對(duì)定容后的雞桑葉提取液進(jìn)行多糖含量的測(cè)定，并計(jì)算出雞桑葉多糖的提取率：

其中：b為雞桑葉多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液定容后的體積，mL；m為雞桑葉質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

在其它條件固定的條件下，固定超聲功率80 W、超聲時(shí)間25 min、超聲溫度75℃和液料比20∶1（mL/g），考察超聲功率（60、70、80、90 W 和 100 W）、超聲時(shí)間（15、20、25、30 min 和 35 min）、超聲溫度（65、70、75、80℃和85℃）和液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）和30 ∶1（mL/g）]、對(duì)雞桑葉多糖提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)1.2.3試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以雞桑葉多糖提取率為響應(yīng)值，以超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）和液料比（D）四因素為自變量，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，因子編碼及水平如表1所示。

表1 因素與水平編碼表Table1 Code table of factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲功率的影響

超聲功率對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on yield of polysaccharides

由圖1可知，當(dāng)超聲功率達(dá)到80 W時(shí)，雞桑葉多糖提取率達(dá)到最大值。這是因?yàn)樘崛∠到y(tǒng)的空化、剪切等作用會(huì)隨著超聲功率的增大而增強(qiáng)，從而促進(jìn)了多糖的溶出，而當(dāng)超聲功率過(guò)大時(shí)，空化等作用太強(qiáng)，溶劑中的某些區(qū)域會(huì)瞬時(shí)升溫，部分多糖分子鏈會(huì)斷裂而分解[7]。因此超聲功率選擇為80 W。

2.1.2 超聲時(shí)間的影響

超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield of polysaccharides

由圖2可知，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到25 min時(shí)，雞桑葉多糖提取率達(dá)到最大值。這是因?yàn)殡u桑葉顆粒與溶劑的接觸與傳質(zhì)時(shí)間會(huì)隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，促進(jìn)多糖的溶出，而當(dāng)超聲時(shí)間太長(zhǎng)時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間的空化和熱等作用下，多糖分子鏈會(huì)斷裂而分解[8]。因此超聲時(shí)間選擇為25 min。

2.1.3 超聲溫度的影響

超聲溫度對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on yield of polysaccharides

由圖3可知，當(dāng)超聲溫度達(dá)到75℃時(shí)，雞桑葉多糖提取率達(dá)到最大值。這是因?yàn)樘崛∠到y(tǒng)溶劑與雞桑葉顆粒的碰撞與傳質(zhì)會(huì)隨著超聲溫度的升高而增大，從而使得多糖溶出量增大，而當(dāng)超聲溫度過(guò)高時(shí)，多糖中耐熱性較差的部分會(huì)發(fā)生熱分解[9]。因此超聲溫度選擇為75℃。

2.1.4 料液比的影響

液料比對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-material ratio on yield of polysaccharides

由圖4可知，當(dāng)液料比達(dá)到20∶1（mL/g）時(shí)，雞桑葉多糖提取率達(dá)到最大值，這是因?yàn)殡u桑葉顆粒內(nèi)部多糖與溶劑間的濃度梯度會(huì)隨著提取體系溶劑量增加而增大，使得多糖更容易溶出，而當(dāng)液料比過(guò)大時(shí)，雞桑葉顆粒中的雜質(zhì)會(huì)與多糖產(chǎn)生溶出競(jìng)爭(zhēng)[10]。因此液料比選擇為 20 ∶1（mL/g）。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化雞桑葉多糖工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)

在2.1單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，以雞桑葉多糖提取率為響應(yīng)值，得到試驗(yàn)結(jié)果如表2，并進(jìn)行響應(yīng)面與方差分析得表3。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Box-Benhnken design and result

表3 回歸模型的分析結(jié)果Table3 Analysis results of regression

續(xù)表3 回歸模型的分析結(jié)果Continue table 3 Analysis results of regression

雞桑葉多糖提取率（Y）與超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）和液料比（D）四因素的四元二次回歸方程可通過(guò)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得到：

表3的顯著性和方差分析顯示，該回歸方程極顯著（F=24.02，P＜0.000 1）；相關(guān)系數(shù) R2=0.960 0，說(shuō)明有超過(guò)96%以上的真實(shí)值可以用該模型來(lái)反映。失擬項(xiàng)不顯著（F=5.56，P=0.056 3＞0.05），說(shuō)明該模型擬合情況較好，受其它因素影響較小。回歸方程中一次項(xiàng)D，交互項(xiàng)AC、AD對(duì)雞桑葉多糖提取率影響不顯著（P＞0.05）；一次項(xiàng)A、B對(duì)雞桑葉多糖提取率影響顯著（P＜0.05）；一次項(xiàng) C，交互項(xiàng) AB、BC、BD、CD，二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2對(duì)雞桑葉多糖提取率影響極顯著（P＜0.01），說(shuō)明雞桑葉多糖提取率與所考察的超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度和液料比等工藝與之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。從方差分析中的F值及P值可知，所考察的4個(gè)因素的主次順序?yàn)椋撼暅囟龋境暪β剩境晻r(shí)間＞液料比。綜上分析，說(shuō)明該響應(yīng)面模型有效，可靠性好。

2.2.2 交互作用分析

利用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度和液料比之間兩兩交互作用的關(guān)系作出響應(yīng)面及等高線圖，如圖5所示。通過(guò)圖中可以得到所考察因素所對(duì)應(yīng)范圍內(nèi)的極大值點(diǎn)，從等高線可以看出各因素的影響程度。

圖5 各因素交互作用對(duì)多糖提取率的影響Fig.5 Effect of factors interaction on yield of polysaccharide

由圖5a可知，超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)雞桑葉多糖提取率的交互作用極顯著，當(dāng)超聲功率為80 W，超聲時(shí)間為25 min時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大；從等高線圖可知，超聲功率對(duì)多糖提取率影響比超聲時(shí)間更為顯著。由圖5b可知，超聲功率和超聲溫度對(duì)雞桑葉多糖提取率的交互作用不顯著，當(dāng)超聲功率為80 W，超聲溫度為75℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大；從等高線圖可知，超聲溫度對(duì)多糖提取率影響比超聲功率更為顯著。由圖5c可知，超聲功率和液料比對(duì)雞桑葉多糖提取率的交互作用不顯著，當(dāng)超聲功率為80 W，液料比為20∶1（mL/g）時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大；從等高線圖可知，超聲功率對(duì)多糖提取率影響比液料比更為顯著。由圖5d可知，超聲時(shí)間和超聲溫度聲時(shí)間對(duì)雞桑葉多糖提取率的交互作用極顯著，當(dāng)超聲時(shí)間為25 min，超聲溫度為75℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大；從等高線圖可知，超聲溫度對(duì)多糖提取率影響比超聲時(shí)間更為顯著。由圖5e可知，超聲時(shí)間和液料比對(duì)雞桑葉多糖提取率的交互作用極顯著，當(dāng)超聲時(shí)間為25 min，液料比為20∶1（mL/g）時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大；從等高線圖可知，超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率影響比液料比更為顯著。由圖5f可知，超聲溫度和液料比對(duì)雞桑葉多糖提取率的交互作用極顯著，當(dāng)超聲溫度為80℃，液料比為25∶1（mL/g）時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大；從等高線圖可知，超聲溫度對(duì)多糖提取率影響比液料比更為顯著。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用響應(yīng)面軟件對(duì)所得的二次回歸方程進(jìn)行分析得到雞桑葉多糖的最佳提取工藝為超聲功率80.23 W、超聲時(shí)間25.86 min、超聲溫度73.28℃和液料比18.71∶1（mL/g），在最佳的預(yù)測(cè)工藝條件下，多糖提取率的最大值為48.41 mg/g。結(jié)合試驗(yàn)操作的便利性，將工藝修正為超聲功率80 W、超聲時(shí)間26 min、超聲溫度73℃和液料比19∶1（mL/g），在修正后的工藝條件下，進(jìn)行平行試驗(yàn)，得到雞桑葉多糖的平均提取率為 48.21 mg/g，與預(yù)測(cè)值相比（48.41 mg/g），其相差為0.41%，說(shuō)明該響應(yīng)面模型有效，可靠性好，該研究為雞桑葉多糖的深度開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

3 結(jié)論

以雞桑葉為原料，對(duì)影響雞桑葉多糖提取率因素進(jìn)行考察并進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面優(yōu)化，獲得最佳提取工藝為：超聲功率80 W、超聲時(shí)間26 min、超聲溫度73℃和液料比19∶1（mL/g）。在該條件下，雞桑葉多糖的提取率為48.21 mg/g，與預(yù)測(cè)值相比（48.41 mg/g），其相差為0.41%，說(shuō)明該響應(yīng)面模型有效，可靠性好。該研究為雞桑葉多糖的深度開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。