易思明 范曉越 董子鈺 王歲樓*

（中國藥科大學(xué)工學(xué)院，江蘇南京 211198）

紅葉石楠為薔薇科石楠屬雜交種的統(tǒng)稱，是常綠小喬木，其新梢和嫩葉為鮮紅色，有“紅衣衛(wèi)士”“綠籬之王”的美稱。紅葉石楠的功能性色素成分之一為花色苷，是一類水溶性黃酮類物質(zhì)，具有很多生理活性。目前國內(nèi)對紅葉石楠的研究應(yīng)用大多在培養(yǎng)繁殖技術(shù)、園林技術(shù)等方面，鮮有對其色素研究的報(bào)道。本文對紅葉石楠紅色素的提取及分離純化工藝進(jìn)行初步研究，旨在為紅葉石楠的綜合利用及其功能性色素的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

紅葉石楠葉，2017年5月采于中國藥科大學(xué)寧江校園第二食堂前。

無水乙醇、丙酮、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、鹽酸等，均為分析純試劑。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

DF Y-500高速中藥粉碎機(jī)；DZF-6050真空干燥箱；T U-1810型紫外可見分光光度計(jì)；K H-100B型超聲儀；R E-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；離心機(jī)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱。

1.2 提取方法

將采摘的紅葉石楠葉清洗后，瀝干，放入烘烤箱內(nèi)干燥24 h，取出后放入真空干燥箱內(nèi)進(jìn)一步干燥2 h。然后粉碎過篩（100目），得到紅葉石楠葉粉末。稱取1 g紅葉石楠葉粉末，加入一定料液比的提取劑，在一定溫度下超聲提取一定時(shí)間，在5 000 r/min條件下離心5min，離心后取上清液即為紅色素粗提液。按1.4所述方法，測定和計(jì)算提取液中花色苷總含量。

1.2.1 提取溶劑的選擇

稱取1 g紅葉石楠葉粉末,分別以蒸餾水、丙酮、乙酸乙酯、75%乙醇（加2%鹽酸）、無水乙醇（加2%鹽酸） 為提取劑，料液比 1∶30（g∶mL），40 ℃下超聲提取40min。

1.2.2 料液比提取選擇

稱取1 g紅葉石楠葉粉末各1 g，以75%乙醇為提取劑，在40℃下，分別以料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 （g∶mL） 超聲提取 40min。

1.2.3 提取時(shí)間的選擇

稱取1 g紅葉石楠葉粉末，以75%乙醇為提取劑，料液比為1∶30（g∶mL） 在40℃條件下超聲提取 20min、30min、40min、50min、60min。

1.2.4 提取溫度的選擇

稱取1 g紅葉石楠葉粉末，以75%乙醇，料液比為 1∶30（g∶mL），分別在 30 ℃、40 ℃、50 ℃、60℃、70℃下超聲提取40min。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、料液比4個(gè)因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)，以確定最優(yōu)提取方案。因素水平見表1。

表1 紅葉石楠紅色素提取的正交試驗(yàn)因素及水平

1.3 純化方法

將活化后的硅膠與洗脫劑濕法裝柱，加入旋蒸后的紅色素粗提液，分別用石油醚-丙酮（9∶1）和丙酮沖洗至流出液無色，然后用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液以一定的流速解析，得到純化后的紅葉石楠紅色素溶液，在525 nm處測定吸光度，計(jì)算出純化液中花色苷總含量。

1.3.1 吸附溫度的選擇

將紅色素粗提液與硅膠在25℃、35℃、45℃條件下恒溫振蕩24 h。然后在525 nm處測得其吸光度。

1.3.2 上柱液量的選擇

分別加入1mL、2mL、3mL、4mL紅色素上柱液，分別用石油醚-丙酮（9∶1） 和丙酮沖洗至流出液無色，然后用50%乙醇溶液以1mL/min流速解析，測定流出液的吸光度。

1.3.3 洗脫劑濃度的選擇

分別加入2mL紅色素上柱液，分別用石油醚-丙酮（9∶1）和丙酮沖洗至流出液無色，然后分別用30%、40%、50%、60%乙醇以1mL/min流速解析，測定流出液的吸光度。

1.3.4 流速的選擇

分別加入2mL紅色素上柱液，分別用石油醚-丙酮（9∶1）和丙酮沖洗至流出液無色，然后分別用50%乙醇以 0.5 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min、2 mL/min流速解析，測定流出液的吸光度。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（33）正交試驗(yàn)方法，對洗脫液乙醇濃度、上柱液體積、流速3因素做進(jìn)一步優(yōu)化，其因素及水平見表2。

表2 紅葉石楠紅色素純化的正交試驗(yàn)因素及水平

1.4 測定方法

在波長525 nm處測定粗提液或者純化液的吸光度值，然后根據(jù)Fuleki公式計(jì)算出花色苷總含量：花色苷含量 （mg/100mL） =[(A U V-V IS-MAXA1700)1-(A U V-V IS-MAX-A1700)2]×M w×DF×10 000/ε，其中：1為pH=1.0時(shí)吸光度之差，2為pH=4.5時(shí)吸光度之差，DF為稀釋倍數(shù)。本試驗(yàn)以矢車菊-3-葡萄糖苷作為標(biāo)準(zhǔn)物，其相對分子質(zhì)量M w=449.2，摩爾消光系數(shù)ε=26900。

根據(jù)所添加的紅葉石楠葉片粉末的質(zhì)量（mg）與稀釋體積（mL），可以換算為原料石楠葉中花色苷的提取率：

石楠葉花色苷提取率（W/W,%） =（提取液花色苷含量/葉片粉末質(zhì)量/稀釋體積）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

溶劑對紅葉石楠紅色素提取效果的影響見圖1。

圖1 溶劑對紅葉石楠紅色素提取效果的影響

由圖1可知，不同提取劑提取效果明顯不同，當(dāng)提取劑為75%乙醇時(shí)，提取效果最好。

料液比對紅葉石楠紅色素提取效果的影響見圖2。

圖2 料液比對紅葉石楠紅色素提取效果的影響

由圖2可知，不同料液比對色素提取效果影響顯著，最佳料液比為1：20。

時(shí)間對紅葉石楠紅色素提取效果的影響見圖3。

由圖3可知，提取時(shí)間影響很大，最優(yōu)提取時(shí)間為40min。當(dāng)提取時(shí)間低于40min時(shí)，色素提取不完全，當(dāng)提取時(shí)間超過40min時(shí)，可能導(dǎo)致其他物質(zhì)溶解和擴(kuò)散。

溫度對紅葉石楠紅色素提取效果的影響見圖4。

圖3 時(shí)間對紅葉石楠紅色素提取效果的影響

圖4 溫度對紅葉石楠紅色素提取效果的影響

由圖4可知，最優(yōu)提取溫度為50℃。當(dāng)溫度過低時(shí)，色素提取不完全，但溫度過高時(shí)，可能導(dǎo)致色素破壞。

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

紅葉石楠紅色素提取的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 紅葉石楠紅色素提取的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可以看出，正交試驗(yàn)中4個(gè)因素對紅葉石楠紅色素提取都有一定影響。比較極差R大小，可知各因素影響次序?yàn)椋毫弦罕龋咎崛r(shí)間＞乙醇濃度＞提取溫度；比較同一因素不同水平的結(jié)果，得知最優(yōu)條件組合為A1B2C3D2，按此最優(yōu)理論組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果與正交試驗(yàn)中2號結(jié)果接近，因此選定2號的試驗(yàn)條件A1B2C2D2為最佳提取方案：即提取溶劑為50%乙醇，料液比為1∶20（g∶mL），提取溫度為50℃，提取為40min，此時(shí)提取液中花色苷含量可達(dá)4.21mg/100mL，換算成葉片中總花色苷提取率（%） 為0.084 2。

2.2 純化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

溫度對硅膠吸附性能的影響見圖5。

圖5 溫度對硅膠吸附性能的影響

由圖5可見，靜態(tài)吸附時(shí)溫度對硅膠性能影響不大，為了方便操作，選擇在室溫下進(jìn)行。

上柱液量對紅葉石楠紅色素純化效果的影響見圖6。

圖6 上柱液量對紅葉石楠紅色素純化效果的影響

由圖6可見，當(dāng)紅色素上柱液體積為3mL時(shí)，純化后的紅色素吸光度最大。隨著上柱液體積增大，吸光度變化不明顯，說明在紅色素上柱液體積為3mL時(shí)，硅膠吸附達(dá)到飽和，吸附劑不再吸附樣液。

洗脫劑濃度對紅葉石楠紅色素純化效果的影響見圖7。

圖7 洗脫劑濃度對紅葉石楠紅色素純化效果的影響

由圖7可見，當(dāng)以50%乙醇作為洗脫劑時(shí)所測得的吸光度最大。

流速對紅葉石楠紅色素純化效果的影響見圖8。

圖8 流速對紅葉石楠紅色素純化效果的影響

由圖8可見，隨著流速的增加，紅色素的吸光度逐漸下降。

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

紅葉石楠紅色素純化的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 紅色素純化的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可以看出，正交試驗(yàn)中3個(gè)因素對紅葉石楠紅色素的純化效果都有一定的影響。比較極差R大小，可知各因素影響次序?yàn)椋合疵撘簼舛龋玖魉伲旧现后w積。比較同一因素不同水平的結(jié)果，得知最優(yōu)條件組合為A2B1C2，此最優(yōu)理論組合正好與正交試驗(yàn)中4號試驗(yàn)的條件組合一致。因此，選定A2B1C2為紅葉石楠紅色素純化的最佳工藝參數(shù)組合，即40%乙醇作洗脫劑，上柱液體積3mL，以1mL/min流速進(jìn)行洗脫。

由以上最佳條件的試驗(yàn)結(jié)果可以得出：純化倍數(shù)=(1.08/4.21)×10=2.57，其中1.08mg/100mL為純化后花色苷含量最大值，4.21mg/100mL為提取液花色苷含量最大值，10為稀釋倍數(shù)。

3 結(jié)論

紅葉石楠紅色素提取的最佳條件為：采用50%乙醇為提取劑，料液比1∶20（g∶mL），在50℃下提取40min，花色苷提取率可達(dá)0.084 2%。

紅色素粗提液純化的最佳工藝條件為：在室溫下，以硅膠作吸附劑，40%乙醇作洗脫劑，加樣量為3mL，以1mL/min流速進(jìn)行洗脫，純化倍數(shù)可達(dá)2.57。

試驗(yàn)結(jié)果表明，從紅葉石楠提取制備紅色素是可行性的，其提取與純化工藝條件值得進(jìn)一步研究優(yōu)化。