易小友 何容涵 廖瑛揚(yáng) 王哲 江詩海 王昆

關(guān)節(jié)纖維化是指關(guān)節(jié)手術(shù)或者關(guān)節(jié)長期制動導(dǎo)致的主動或被動的關(guān)節(jié)活動度(ROM)的喪失，臨床表現(xiàn)為持續(xù)性的主動及被動活動受限[1]。關(guān)節(jié)纖維化發(fā)生的機(jī)制目前尚未明確，公認(rèn)的是，關(guān)節(jié)周圍原位成纖維肌活化并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[1-3]。組織學(xué)上主要表現(xiàn)為α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)陽性的肌成纖維細(xì)胞活化、聚集并分泌大量以Ⅰ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)成分。因此，阻斷成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積成為治療關(guān)節(jié)纖維化的主要方向。

含t復(fù)合多肽伴侶素亞基(CCT)是廣泛存在于真核細(xì)胞胞質(zhì)中的一種重要分子伴侶，以維持相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的正常功能[4-6]。任何亞基的變化均會導(dǎo)致細(xì)胞不同的生物學(xué)改變。前期研究顯示，CCT-7在成纖維細(xì)胞的活化過程中是高表達(dá)的，另有研究也顯示CCT-7在皮膚瘢痕形成、關(guān)節(jié)纖維化過程中亦是高表達(dá)的[4-6]。有研究顯示CCT-6參與皮膚瘢痕的形成[7]。CCT-6可以分為6a和6b。在肺的非小細(xì)胞肺癌中，CCT-6a已被證實(shí)能夠通過轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)通路調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的代謝，而TGF-β信號通路具有最強(qiáng)的致纖維化作用[8-10]。Rommelaere等[11]在動物的睪丸中最早發(fā)現(xiàn)CCT-6b高表達(dá)，但筆者見目前CCT-6b在纖維化方面缺乏相關(guān)研究，因此在本研究中，通過篩查關(guān)節(jié)纖維化的成纖維細(xì)胞中CCT家族各個(gè)亞基的表達(dá)，探索各亞基在關(guān)節(jié)纖維化中的可能作用，為臨床上治療關(guān)節(jié)纖維化指明方向。

材料與方法

一、主要實(shí)驗(yàn)試劑

全蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒(CCK-8試劑盒)購自Keygen公司，總RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司，實(shí)驗(yàn)抗體均購自Abclonal公司，一步法PCR試劑盒購自Takara公司，引物合成由谷歌生物公司合成。

二、方 法

1.關(guān)節(jié)纖維化動物模型的建立

本動物實(shí)驗(yàn)通過中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。成年SD大鼠(雌性)12只，體質(zhì)量280～320 g，取其右下肢為固定組，左下肢為對照組。固定組以1%戊巴比妥鈉5 ml/kg腹腔注射麻醉后，沿膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切開皮膚，分離皮下組織和肌肉，顯露股骨遠(yuǎn)端、膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)及脛骨近端。保持膝關(guān)節(jié)屈曲至45°左右時(shí)放置聚甲醛樹脂板(POM板)，以1.1 mm電鉆于股骨內(nèi)側(cè)遠(yuǎn)端、脛骨內(nèi)側(cè)近端鉆孔，用POM板及2枚直徑1.2 mm、長16 mm不銹鋼螺釘將膝關(guān)節(jié)固定約45°(圖1A)，隨后縫合傷口。對照組不作處理。在8周時(shí)間內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)大鼠(圖1B)。

圖1 大鼠膝關(guān)節(jié)纖維化模型的建立

2.大鼠膝關(guān)節(jié)最大伸直角度的測量

手術(shù)8周后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，取出不銹鋼螺釘和POM板，小心剔除膝關(guān)節(jié)周圍的肌肉、韌帶等組織，保證膝后方關(guān)節(jié)囊完好。用角度測量器測量固定組和對照組膝關(guān)節(jié)的活動度(ROM)，完全伸直的膝關(guān)節(jié)記為180°，比較2組膝關(guān)節(jié)的最大伸直角度，以評估關(guān)節(jié)纖維化的嚴(yán)重程度(圖1C)。

3.大鼠膝關(guān)節(jié)囊原代細(xì)胞的培養(yǎng)

分離大鼠膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊，用大量含雙抗(100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素)的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗組織塊，去除肌肉、肌腱、脂肪等周圍組織，將組織剪碎成1 mm×1 mm大小，均勻鋪至25 cm2培養(yǎng)瓶底部，倒置放入體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，約3 h后取出，組織塊貼壁后再加入含10%胎牛血清的高糖Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，將培養(yǎng)瓶平置放入培養(yǎng)箱中。每隔2 d取出換液。約第7日可鏡下觀察到部分貼壁組織塊周邊有成纖維樣細(xì)胞爬出，約第14日，可見成纖維樣細(xì)胞大量接觸成片，即為原代成纖維細(xì)胞。常規(guī)消化細(xì)胞傳代，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，此后每隔2 d取出細(xì)胞換液1次。

4.Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

取2組細(xì)胞饑餓培養(yǎng)12 h，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/ml，取200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室中，下層小室加入600 μl含10%胎牛血清的高糖DMEM，每組細(xì)胞設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后取出上層小室，用PBS清洗2次，再用4%多聚甲醛固定10 min后，清洗小室2次，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗去多余染劑，置于倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×100)進(jìn)行拍照及細(xì)胞計(jì)數(shù)。以穿過Transwell小室微孔細(xì)胞的數(shù)量代表該組細(xì)胞的遷移能力。

5.CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取2組細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，取100 μl細(xì)胞懸液加入96孔板中，每組細(xì)胞設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后取出96孔板，按試劑盒說明書操作。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD450)在各個(gè)孔的讀數(shù)，計(jì)算每組細(xì)胞的增殖活力。

6.蛋白免疫印跡試驗(yàn)

采用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測2組成纖維細(xì)胞的α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白(COL-1)表達(dá)水平及CCT家族各亞基表達(dá)水平。提取2組細(xì)胞總蛋白溶液，根據(jù)目的蛋白分子量選擇分離膠為12%濃度、濃縮膠5%濃度，設(shè)定電壓80 V電泳30 min，待樣品進(jìn)入分離膠后改電壓為120 V電泳約30 min。按恒定電流200 mA轉(zhuǎn)膜60 min，用TBST配制5 % 脫脂牛奶作為封閉液，封閉1 h。按1∶1 000稀釋一抗，4 ℃孵育過夜。按1∶5 000稀釋二抗，室溫孵育60 min。洗膜后取出浸沒于5 ml增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光液中約1 min，可置入Fluor Chem M多色熒光蛋白免疫印跡成像系統(tǒng)，進(jìn)行自動曝光成像。

7.實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測2組細(xì)胞的CCT家族各亞基基因表達(dá)，提取2組細(xì)胞的總RNA，使用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(One Step SYBR Prime Script RT-PCR Kit)，根據(jù)目的基因的序列設(shè)計(jì)并合成引物，按試劑盒說明書操作，組成20 μl real-time PCR反應(yīng)體系，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參(表1)。應(yīng)用Applied Biosystems 7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，按說明書設(shè)定條件。PCR反應(yīng)共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后讀取每個(gè)孔的CT值做分析，以2-ΔΔCT計(jì)算2組細(xì)胞每個(gè)目的基因的mRNA的相對表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 實(shí)驗(yàn)使用的PCR引物序列

結(jié) 果

一、固定組與對照組大鼠膝關(guān)節(jié)最大伸直角度比較

術(shù)后8周時(shí)間內(nèi)2組大鼠均無死亡、局部感染、固定松動等情況。拆除內(nèi)固定后，比較2組膝關(guān)節(jié)的最大伸直角度，固定組12個(gè)關(guān)節(jié)的膝關(guān)節(jié)最大伸直角度為(97.7±6.5)°，對照組12個(gè)關(guān)節(jié)的膝關(guān)節(jié)最大伸直角度為(158.3±8.2)°，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.570,P<0.001)。

二、固定組與對照組大鼠成纖維細(xì)胞的表型差異

組織貼壁法分離的原代細(xì)胞，細(xì)胞為長梭形的成纖維樣，經(jīng)過消化傳代后，固定組和對照組細(xì)胞均為貼壁生長的成纖維樣，細(xì)胞外形、生長特點(diǎn)基本一致，呈長梭形。與對照組相比，固定組細(xì)胞觸角伸展更多，體積更大，細(xì)胞接觸相對更緊密，見圖2。

圖2 膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊原代成纖維細(xì)胞光鏡下形態(tài)

三、固定組與對照組大鼠成纖維細(xì)胞遷移能力比較

Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，固定組細(xì)胞在高倍鏡(×100)視野下平均遷移出小室的細(xì)胞數(shù)量為(84±7)個(gè)、對照組成纖維細(xì)胞為(51±5)個(gè)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.635，P<0.001)。即固定組成纖維細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，見圖3。

四、固定組與對照組大鼠成纖維細(xì)胞增殖活力比較

固定組成纖維細(xì)胞的OD450為1.131±0.016，對照組為0.698±0.018，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.010，P<0.001)，見圖4。

圖3 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

五、固定組與對照組大鼠成纖維細(xì)胞α-SMA、COL-1表達(dá)的比較

固定組α-SMA表達(dá)灰度值為0.482±0.025，對照組為0.130±0.007，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.57，P<0.001)；固定組COL-1表達(dá)灰度值為1.235±0.060，對照組為0.356±0.019，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.96，P<0.001)，見圖5A。

固定組α-SMA的基因表達(dá)為對照組的(5.399±0.096)倍(t=44.65，P<0.001)；COL-1的基因表達(dá)為對照組的(1.615±0.050)倍(t=12.28，P<0.001)，見圖5B。

六、固定組與對照組細(xì)胞表達(dá)CCT家族各亞基情況的比較

固定組成纖維細(xì)胞CCT-6b蛋白表達(dá)灰度值較對照組低(P<0.001)，CCT-1、CCT-2、CCT-4、CCT-6a、CCT-7則較高(P均<0.05)，見表2、圖6。

圖5 α-SMA、COL-1蛋白和基因表達(dá)情況

表2 固定組與對照組大鼠CCT各亞基蛋白表達(dá)灰度值比較

圖6 蛋白免疫印跡顯示CCT家族各亞基的蛋白表達(dá)變化

七、固定組與對照組大鼠細(xì)胞表達(dá)CCT家族各亞基基因表達(dá)的比較

固定組成纖維細(xì)胞CCT-6b基因表達(dá)較對照組低(P<0.001)，CCT-7基因2組比較無差異，其余亞基固定組均較對照組高(P均<0.05),見表3、圖7。

表3 固定組與對照組CCT各個(gè)亞基mRNA表達(dá)的相對定量值

圖7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示CCT家族各亞基的基因表達(dá)變化，與對照組比較，*P<0.05

討 論

目前關(guān)節(jié)纖維化的治療方法主要是通過手術(shù)松解纖維組織以及物理治療，達(dá)到增加關(guān)節(jié)活動度的目的，但是物理治療效果不佳，手術(shù)也存在術(shù)后加重關(guān)節(jié)攣縮以及感染、出血等風(fēng)險(xiǎn)。既往研究表明，在心臟、肝臟、皮膚、肺臟等器官的纖維化過程中，成纖維細(xì)胞受到刺激轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，表達(dá)并分泌大量α-SMA、COL-1，且細(xì)胞的增殖活力、遷移能力增強(qiáng)[1-3,12-13]。本研究結(jié)果顯示，在固定大鼠膝關(guān)節(jié)8周后，測量膝關(guān)節(jié)最大伸直角度發(fā)現(xiàn)固定組關(guān)節(jié)活動度降低，固定組細(xì)胞相對于對照組細(xì)胞在細(xì)胞表型上更接近于肌成纖維細(xì)胞，并且細(xì)胞遷移能力、增殖活力增高，在蛋白水平和基因水平上均表達(dá)更多的α-SMA、COL-1，以上結(jié)果均與既往研究結(jié)果相同[4]。因此，本研究大鼠膝關(guān)節(jié)纖維化動物模型建立成功，細(xì)胞適用于關(guān)節(jié)纖維化疾病的進(jìn)一步研究。

CCT家族在真核細(xì)胞中普遍存在并參與了許多生物學(xué)過程。有研究者已證實(shí)CCT-7在纖維化疾病中是升高的，干擾CCT-7表達(dá)后細(xì)胞纖維化指標(biāo)明顯下降[4]。在本研究中，筆者篩查了關(guān)節(jié)纖維化的成纖維細(xì)胞CCT家族各亞基的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，固定組CCT-6b蛋白和基因表達(dá)均較低，CCT-1、CCT-2、CCT-4、CCT-6a、CCT-7蛋白表達(dá)較高，CCT-1、CCT-2、CCT-4、CCT-6a基因表達(dá)較高。而Satish等(2008年)的研究證實(shí)，CCT-2在其它CCT亞基發(fā)生變化時(shí)的變化較小。目前缺乏CCT-6b在纖維化疾病中的相關(guān)研究，既往Walkley等(1996年)對CCT-6的研究顯示，CCT-6在折疊肌動蛋白和微管蛋白中具有關(guān)鍵作用，而且與CCT-3具有54%的基因相似程度。有研究顯示，在口腔黏膜損傷修復(fù)過程中，CCT-6的基因表達(dá)水平明顯高于未損傷的對照組[7]。另一項(xiàng)研究則顯示CCT-6基因在正常胎兒皮膚中高表達(dá)，而成年人皮膚中相對低表達(dá)，提示CCT-6可能與皮膚瘢痕形成(皮膚纖維化)有一定關(guān)系。因此在本研究中的大鼠關(guān)節(jié)纖維化模型中，固定組成纖維細(xì)胞CCT-6b表達(dá)下調(diào)可能是成纖維細(xì)胞活化過程的標(biāo)志，提示了CCT-6b可能參與了成纖維細(xì)胞纖維化的過程，并可能是抗纖維化因子，但其中的具體變化還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

目前關(guān)節(jié)纖維化的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，其病理生理學(xué)過程未得到合理的解釋，這也是臨床上預(yù)防和治療關(guān)節(jié)纖維化效果不佳的主要原因。本研究通過構(gòu)建關(guān)節(jié)纖維化動物模型，發(fā)現(xiàn)固定后的成纖維細(xì)胞遷移能力、增殖能力增強(qiáng)，表達(dá)α-SMA、COL-1增高，CCT-6b的蛋白和基因表達(dá)下調(diào)，提示CCT家族參與了關(guān)節(jié)纖維化的發(fā)生，其中CCT-6b可能作為抗纖維化因子參與了細(xì)胞纖維化過程。