余高鋒 李會(huì)仁 金尚怡

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是麻醉和術(shù)后出現(xiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，其臨床癥狀主要包括認(rèn)知能力降低、理解水平下降、記憶減退等[1-2]。研究證實(shí)七氟醚與POCD的發(fā)生有密切聯(lián)系，七氟醚致POCD的機(jī)制與β-淀粉樣蛋白(Aβ)刺激膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子和細(xì)胞因子有關(guān)[3-4]。程序性死亡受體1(PD-1)參與細(xì)胞凋亡并可從多個(gè)層面阻止T、B淋巴細(xì)胞的激活[5-6]。PD-1與其內(nèi)源性配體程序性死亡受體配體1(PD-L1)結(jié)合后發(fā)揮作用，但PD-1/PD-L1通路在七氟醚致POCD中的作用尚未明確。本研究旨在探討PD-1/PD-L1通路在七氟醚致大鼠POCD中的作用。

材料與方法

一、動(dòng)物及分組

取18只4月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量為260～290 g，購(gòu)自廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地。在動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)7 d，室溫25 ℃，濕度40%，不控制飲水，常規(guī)飲食。將其隨機(jī)分為3組各6只，包括生理鹽水組(NS組)、七氟醚致POCD組(POCD組)和PD-1/PD-L1通路阻斷組(B組)。

二、方 法

1.七氟醚致POCD模型制備

于大鼠海馬區(qū)注射Aβ1-40制備模型，腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg進(jìn)行麻醉，應(yīng)用大鼠腦立體定向儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)定位雙側(cè)海馬CA1區(qū)，鉆開(kāi)顱骨暴露硬腦膜，用微量進(jìn)樣器(上海激光醫(yī)學(xué)儀器廠)從腦表面定位點(diǎn)垂直進(jìn)針，依次將Aβ1-40(5 μg/μl，使用前37 ℃孵育7 d)2 μl注入POCD組及B組大鼠雙側(cè)海馬，注射時(shí)長(zhǎng)5 min，留針5 min，確保Aβ1-40完全浸潤(rùn)局部組織，NS組則等速注射等體積生理鹽水。注射完后所有實(shí)驗(yàn)大鼠局部消毒后縫合皮膚，腹腔注射慶大霉素2萬(wàn)單位后常規(guī)飼養(yǎng)。B組大鼠海馬內(nèi)注射PD-L1單克隆抗體E1J2J 1 μl(貨號(hào)15165S，美國(guó)CST公司)，POCD組和NS組大鼠海馬內(nèi)注射等體積生理鹽水。術(shù)后30 d按文獻(xiàn)[7]制備七氟醚致POCD模型，給予POCD組和B組大鼠2.0最低肺泡有效濃度(MAC)的七氟醚+氧氣(濃度50%)處理4 h；NS組空氣處理4 h。各組氣體流量均設(shè)為2 L/min。

2.行為學(xué)測(cè)定及標(biāo)本制備

大鼠術(shù)前5 d開(kāi)始Morris水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，4次/日，持續(xù)5 d。以池壁上4個(gè)等距離點(diǎn)把水池平分成4個(gè)象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，在Ⅳ象限中心位置安放平臺(tái)，直徑15 cm，高度33 cm，沒(méi)入水下1 cm。大鼠從上述4個(gè)象限面向池壁入水直至其找到平臺(tái)，運(yùn)用any-Maze動(dòng)物行為學(xué)自動(dòng)攝像分析系統(tǒng)記錄大鼠游泳速度、逃避潛伏期、上臺(tái)前路程以及搜索策略。若90 s內(nèi)未發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，則引導(dǎo)其登上平臺(tái)休息30 s，并將逃避潛伏期記為90 s。于術(shù)后51 d行Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試，測(cè)試后予各組大鼠腹腔注射水合氯醛350 mg/kg進(jìn)行麻醉，開(kāi)顱灌流取其海馬組織進(jìn)行測(cè)定。

3.大鼠海馬細(xì)胞凋亡熒光原位檢測(cè)

采用原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)，按照試劑盒說(shuō)明操作。使用Image-pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析，鏡下細(xì)胞核棕色染色細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，每只大鼠取3張切片,各切片在損傷區(qū)任意釆集5個(gè)高倍(400倍)視野。高倍視野下計(jì)算凋亡指數(shù)=調(diào)亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100 %。

4.蛋白免疫印跡法測(cè)定海馬內(nèi)PD-1及PD-L1的表達(dá)

用細(xì)胞裂解液提取蛋白后采用Bradfor法蛋白定量測(cè)定試劑盒(上海美季生物技術(shù)公司)進(jìn)行蛋白定量。通過(guò)Scion Image軟件檢測(cè)PD-1和PD-L1目的條帶，對(duì)比內(nèi)參照β-actin條帶灰度值，其比值為PD-1和PD-L1的相對(duì)表達(dá)量。

5.ELISA法測(cè)定IL-1β和IL-10的含量

用勻漿器研磨組織后于冰浴下超聲波粉碎制勻漿，4 ℃離心取上清液，參照ELISA測(cè)定試劑盒說(shuō)明，測(cè)定IL-1β、IL-10含量。用MK3酶標(biāo)儀測(cè)吸光度OD值，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出IL-1β和IL-10的含量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、大鼠Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

術(shù)后51 d，與NS組比較，POCD組及B組大鼠上臺(tái)前路程增加、逃避潛伏期延長(zhǎng)(P均<0.05)；與POCD組比較，B組大鼠上臺(tái)前路程減少、逃避潛伏期縮短(P均<0.05)；3組大鼠游泳速度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

二、NS組、POCD組及B組大鼠海馬內(nèi)PD-1、PD-L1、炎癥因子及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較

與NS組比較，POCD組大鼠海馬內(nèi)PD-1和PD-L1表達(dá)增強(qiáng)、炎癥因子IL-1β含量增加、抑炎因子IL-10含量減少、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率升高(P均<0.05)；與POCD組比較，B組大鼠海馬內(nèi)PD-L1表達(dá)減弱、炎癥因子IL-1β含量減少、抑炎因子IL-10含量增加、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率降低(P均<0.05)；POCD組與B組大鼠海馬內(nèi)PD-1比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 NS組、POCD組及B組大鼠術(shù)后51 d Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試結(jié)果比較

注：與NS組比較，aP<0.05; 與POCD組比較，bP<0.05

表2 NS組、POCD組及B組大鼠海馬內(nèi)PD-1、PD-L1、炎癥因子及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較

注：與NS組比較，aP<0.05;與POCD組比較，bP<0.05

討 論

雙側(cè)海馬注射Aβ1-40可致大鼠海馬神經(jīng)元線粒體受損并導(dǎo)致其記憶減退和認(rèn)知障礙[8]。本研究采用既往研究方法制備七氟醚致大鼠POCD模型，大鼠認(rèn)知行為學(xué)的改變提示海馬區(qū)注射Aβ1-40后復(fù)合七氟醚處理，可導(dǎo)致大鼠發(fā)生POCD。海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要核團(tuán)，海馬內(nèi)Aβ沉積、神經(jīng)元細(xì)胞外Aβ沉積是早老性癡呆的主要病理特征。Aβ能直接激活膠質(zhì)細(xì)胞分泌和釋放TNF-α、IL-1、IL-6、集落刺激因子、環(huán)氧化酶2和前列腺素等炎癥趨化因子，最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死[9-10]。七氟醚處理可激活大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體，增加鈣離子內(nèi)流并促進(jìn)大量氧自由基生成，從而誘發(fā)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，七氟醚可通過(guò)抑制突觸后膜乙酰膽堿傳遞的方式抑制神經(jīng)元突觸可塑性[11-13]。此外，七氟醚能刺激Aβ的聚集與沉積，對(duì)老年大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力產(chǎn)生傷害[14-15]。本研究結(jié)果表明，NS組大鼠海馬內(nèi)炎癥反應(yīng)以及PD-1與PD-L1的含量均處于較低水平，而POCD組大鼠海馬內(nèi)炎癥反應(yīng)加重并最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，同時(shí)其PD-1和PD-L1表達(dá)增強(qiáng)，這種伴隨性升高提示PD-1/PD-L1通路參與了POCD過(guò)程。

PD-1蛋白由N端細(xì)胞外結(jié)合域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C端胞漿結(jié)構(gòu)域3部分組成，胞漿結(jié)構(gòu)域中含有一個(gè)免疫受體酪氨酸交換模體和一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制模體[16-17]。當(dāng)PD-L1與PD-1受體結(jié)合后，可促進(jìn)PD-1胞漿結(jié)構(gòu)域尾端酪氨酸磷酸化，繼而招募非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP-2)，最終SHP2可使T淋巴細(xì)胞抗原受體相關(guān)蛋白CD-3ζ和ζ鏈相關(guān)蛋白-70去磷酸化，從而調(diào)控了下游病理生理過(guò)程，一方面抑制炎癥因子的分泌， 另一方面抑制PI3K/Akt、mTOR、S6、Erk2等信號(hào)通路的激活[18-20]。在本研究中，POCD大鼠海馬內(nèi)炎癥因子IL-1β含量增加，同時(shí)炎癥因子IL-10含量減少，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，通過(guò)給予PD-L1單克隆抗體，抑制PD-L1與PD-1的結(jié)合從而阻斷PD-1/PD-L1通路后，上述病理生理過(guò)程得以反轉(zhuǎn)，提示PD-1/PD-L1通路是調(diào)控POCD炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的上游關(guān)鍵通路。

綜上所述，PD-1/PD-L1通路在七氟醚致大鼠POCD中起關(guān)鍵作用，阻斷PD-1/PD-L1通路可抑制POCD大鼠海馬內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)，從而降低神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率。