殷 成，何宗澤，何 森

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 成都 610072)

腦動靜脈畸形(Cerebral arteriovenous malformation，AVM)為一種起病突然且常導致患者致殘致死的嚴重腦血管疾病。目前研究發(fā)現(xiàn)AVM的形成可能與胚胎形成、生長發(fā)育及各種顱內(nèi)疾病等多種因素相關[1]，但其準確發(fā)病原因尚未被闡明。人類載脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)俗稱apoE蛋白，腦中apoE含量在人體中位居第二[2]，已有研究證實APOE參與了多種腦出血相關疾病的病理過程[3]。眾所周知某個基因是否表達及表達量取決于特定的啟動子啟動過程，APOE基因的表達同樣受其啟動子調(diào)控，目前認為在APOE啟動子區(qū)存在多個位點的多態(tài)性，而以-219 G/T、-427 T/C和-491 A/T最為重要[4，5]，上述啟動子區(qū)域可在體內(nèi)通過各種等位形式調(diào)控APOE基因的表達量及組織特異性等，因而該區(qū)域的多態(tài)性可能影響中腦血管疾病的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸。因此，本研究擬從啟動子的基因多態(tài)性這個全新角度去探索AVM與APOE基因型多態(tài)性形之間的關系，以求發(fā)現(xiàn)AVM在基因啟動子水平可能存在的發(fā)病機理。

1 資料與方法

1.1一般資料四川省人民醫(yī)院神經(jīng)外科2015年5月至2018年1月收治的AVM住院患者137例，納入標準：①經(jīng)CTA證實的腦AVM；②未出血或首次自發(fā)出血的患者：③臨床資料記錄完整。排除標準：①脊髓動靜脈畸形；②首次出血后再出血腦AVM患者；③出血后存活不足3天的病例。記錄患者的年齡，患高血壓和高血脂與否等基礎臨床資料，同時，所有患者均予以相應的對癥支持治療。該研究得到醫(yī)學倫理委員會的批準，同時獲得患者本人或家屬(患者意識障礙)的同意。

1.2腦動靜脈畸形描述①AVM大小分級，參閱Spetzler-Martin分級法，將CTA圖像所示病變最大直徑為參考標準，分為≤3 cm和>3 cm兩種情況；②依據(jù)畸形血管團的引流靜脈情況分為：僅存在腦表淺靜脈引流和有深部靜脈引流兩種類型；③依據(jù)畸形血管團是否鄰近腦功能區(qū)(感覺運動、語言和視覺皮層，下丘腦和丘腦，內(nèi)囊，腦干，小腦腳，小腦深部神經(jīng)核)分為：鄰近腦功能區(qū)和不鄰近腦功能區(qū)兩種類型。

1.3APOE啟動子基因型的鑒定該流程中患者資料和實驗人員之間為雙盲狀態(tài)。采集患者右側(cè)肘部靜脈血后使用PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)技術檢測。先將血液中全DNA抽提出(DNA抽提試劑盒，Takara公司，日本)，使用引物上游5’-CAAGGTCACACAGCTGGCAAC-3’； 下游5’-TCCAATCGACGGCTAGCTACC-3’，擴增得到1423bp的PCR產(chǎn)物(命名為TrDNA)。隨后使用引物上游5’-CAGAATGGAGGAGGTGTCCG-3’下游5’-GGAGGTGGGGCATAGAGGTCT-3’擴增上述TrDNA，將得到93bp的產(chǎn)物使用MspI內(nèi)切酶(Takara公司，日本)酶切并凝膠電泳分離，-219 G/T分型為：74bp為G等位基因，93bp的為T等位基因。進一步使用引物上游5'-TGTTGGCCAGGCTGGTTTTAA-3’，下游5'-CTTCCTTTCCTGACCCTGTCC-3’擴增TrDNA，將228bp的產(chǎn)物使用AIu I內(nèi)切酶(Takara公司，日本)和Dra I內(nèi)切酶(Takara公司，日本)酶切并電泳分離。-427 T/C分型：144bp和84bp為T等位基因，228bp為C等位基因；-49lA/T型：228bp為T等位基因，200bp和28bp的為A等位基因。

1.4統(tǒng)計學方法統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0軟件。計數(shù)資料以百分數(shù)表示，比較采用卡方檢驗。危險因素分析采用Logistic多元回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1APOE啟動子基因型分布本組137例AVM患者的基因型中，APOE啟動子區(qū)多態(tài)性-219 G/T、-427 T/C、-491 A/T及等位基因頻率見表1，其分布均符合遺傳學Hardy-Weinberg規(guī)律(P> 0.05)，即該研究樣本為遺傳平衡群體。

表1 APOE啟動子基因型分布

2.2APOE啟動子多態(tài)性與AVM直徑本研究納入腦AVM患者137例，其中86例患者AVM直徑≤3 cm，51例患者AVM直徑>3 cm，檢測所有患者的APOE基因啟動子的多態(tài)性。結(jié)果提示：①攜帶有啟動子-219 G/T或-427 T/C的患者，其AVM直徑>3 cm的發(fā)生率無明顯不同(P> 0.05)；②130例攜帶有-491 A的患者中，其AVM直徑>3 cm比例為37.12%，其遠高于27例攜帶有-491 T的患者中5例的AVM直徑>3 cm比例18.52%(P= 0.011)。見表2。

2.3AVM患者相關臨床資料和AVM直徑在本次納入的全部AVM患者中，平均年齡為31.3歲，男73例，女64例，其中有51例患者AVM直徑>3 cm，而86例患者AVM直徑≤3 cm。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上述AVM直徑≥73 cm和直徑≤3 cm組中，其指標涉及年齡、性別、血壓、血脂、病變是否臨近腦功能區(qū)以及是否深靜脈引流，構(gòu)成上差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，見表3。

2.4臨床因素和APOE啟動子亞型單與AVM直徑的Logistic回歸分析在進行單因素Logistic回歸分析時，深靜脈引流與AVM直徑存在相關性，-491 A也與AVM直徑>3 cm存在相關性，是AVM直徑>3 cm的危險因素，而其余啟動子亞型與AVM直徑>3 cm未表現(xiàn)出相關性。多因素Logistic回歸分析仍然發(fā)現(xiàn)-491 A是AVM直徑大于3 cm的危險因素(P= 0.012，OR=1.876，95%CI 0.423～1.709)。

表2 APOE啟動子多態(tài)性和AVM直徑的關系 [n(%)]

表3 137例患者臨床資料與AVM直徑

表4 各因素與AVM的Logistic回歸分析

3 討論

本研究納入137例診斷為AVM的患者，其中有51例患者AVM直徑>3 cm，統(tǒng)計分析提示攜帶有-491 A的患者AVM直徑>3 cm比例顯著高于攜帶有-491 T的患者，且單因素和多因素的Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)-491 A是AVM直徑>3 cm的危險因素。

腦動靜脈畸形是位于腦實質(zhì)中的動靜脈畸形，其畸形血管團位于與有重要功能的腦組織區(qū)域相臨概率高，因為大體積病變會對腦組織造成壓迫效應，此外因AVM盜血導致其原供血區(qū)腦組織的慢性缺血，若畸形血管團破裂出血則對周圍腦組織造成毀滅性后果[6]。目前針對AVM的治療手段包括開顱手術切除、血管內(nèi)介入栓塞和伽瑪?shù)墩丈渲委煹萚7，8]，而血管畸形病變本身的大小仍是用來確定治療手段的重要參考指標，因此本研究將AVM分為>3 cm和≤3 cm兩個組別來進行研究。

既往研究發(fā)現(xiàn)很大比例的腦AVM是散發(fā)的，然而，隨后的證據(jù)支持家庭遺傳因素影響了腦AVM的表型，并支持基因的多態(tài)性與該疾病相關[9]。蛋白質(zhì)表達和功能也許被生物體內(nèi)普遍存在的基因多態(tài)性精確調(diào)控，并最終導致人類具體疾病相關外在表型的改變[10]。例如：有研究發(fā)現(xiàn)ALK-1包含的內(nèi)含子多態(tài)性在腦AVM中存在較高的頻率[11]。其它基因或單核苷酸多態(tài)性也影響顱內(nèi)出血[12]、診斷后的顱內(nèi)再出血[13]、以及顱內(nèi)出血后的治療效果[14]等腦AVM的主要臨床過程。上述研究結(jié)果證實了腦AVM與基因多態(tài)性存在明顯的聯(lián)系，但與人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)關系極為密切的apoE蛋白尚未得到足夠關注。人類apoE蛋白在腦中的總含量位居各個器官中第二位[2]。人體中APOE存在三個等位基因ε2，ε3，ε4，與之相對應則有三個apoE蛋白亞型apoE 2，apoE 3，和apoE 4，三者相互之間僅有一個氨基酸位點不同[15]，卻存在截然不同的生物學效應。已有研究證明apoE的不同亞型與腦AVM的臨床表現(xiàn)存在聯(lián)系。Pawlikowska等發(fā)現(xiàn)APOEε2攜帶者的動靜脈破裂出血率為非攜帶者的5倍[13]。Achrol等的研究納入了經(jīng)歷了手術、介入或栓塞治療后AVM的患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶APOEε2的患者其治療后再出血的風險是非攜帶者的3.2倍，而且該風險僅存在于非手術治療組[14]，上述研究提示腦AVM出血與APOE基因多態(tài)性存在明顯關聯(lián)，但腦AVM的其他特性與APOE的關系尚未被報道，同時能調(diào)控APOE基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的APOE基因啟動子[16]在腦AVM中扮演的角色則從未曾揭示。而在本研究中，則開拓性地探究了APOE基因啟動子多態(tài)性和腦AVM之間的關系。

ApoE為載脂蛋白，通過與其受體結(jié)合而在細胞及組織間轉(zhuǎn)運脂質(zhì)為其基本功能，而人體動靜脈血管作為運送血液的機械管道則主要由內(nèi)皮細胞、纖維蛋白等組成，二者之間表面上似乎不存在聯(lián)系，但本研究卻發(fā)現(xiàn)腦AVM和患者攜帶有APOE啟動子-491 A相關，該結(jié)果可能有如下兩點潛在意義。首先，腦AVM的發(fā)生有可能與顱內(nèi)的脂質(zhì)代謝相關。在成年人群中，脂質(zhì)和血管相關性疾病已被廣泛關注，尤其是導致多個臟器病變的動脈粥樣硬化；而在胚胎時期，也有研究提示脂質(zhì)與顱內(nèi)血管發(fā)育相關，Harland等報道在小雞胚胎發(fā)育過程中，作為脂質(zhì)的前列腺素影響了大血管直徑[17]，因此推測apoE與腦AVM形成過程存在關聯(lián)。其次，載脂蛋白apoE在腦AVM的發(fā)生過程中，很可能不僅僅扮演了其搬運脂質(zhì)的作用，而更可能參與了腦AVM發(fā)生過程中的分子信號通路調(diào)節(jié)?；谀XAVM可能為先天發(fā)育異常，而個體基因在受精卵時期已定型，因此APOE啟動子有可能在胚胎發(fā)育期間即開始扮演其負面角色，通過影響apoE進而干預信號通路調(diào)節(jié)。

綜上所述，本研究盡管首次揭示了在分子層面的APOE啟動子與腦AVM大小的關系，但APOE啟動子如何在AVM的病理生理過程中發(fā)揮作用以及其可能的分子調(diào)控機制仍有待于闡明，以期繼而能助于腦AVM的預防和治療。