任麗君，張麥葉，高彬

(1.咸陽(yáng)市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西 咸陽(yáng) 712000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西 西安 710032；3.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710049)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們的生活水平得到了極大的提高，與此同時(shí)，人們的飲食結(jié)構(gòu)了發(fā)生了巨大的改變，因此2型糖尿病在人群中的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了患者的身體健康的生活質(zhì)量，同時(shí)也造成了家庭和社會(huì)的重?fù)?dān)[1-2]。有關(guān)資料報(bào)道[3]，已確診的糖尿病患者發(fā)生心血管疾病的危險(xiǎn)是正常人的3倍左右，且預(yù)后差。研究表明炎癥因子和糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)。也有研究表明[4]，toll樣受體4與介導(dǎo)先天免疫參與了糖尿病的炎性反應(yīng)。阿托伐他汀可以具有降低、炎癥因子的濃度的效果，同時(shí)還可以提高細(xì)胞免疫力等作用。本研究通過(guò)對(duì)2型糖尿病患者予以阿托伐他汀藥物治療，比較此藥物對(duì)2型糖尿病患者的單核細(xì)胞toll樣受體4和炎癥因子水平的影響，旨在分析阿托伐他汀對(duì)糖尿病患者的抗炎作用。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2013年1月至2015年1月咸陽(yáng)市第一人民醫(yī)院收治的60例2型糖尿病患者為觀察組，同期在進(jìn)行健康體檢的60例正常人作為對(duì)照組。對(duì)照組包括男33例，女性27例，年齡(62.40±2.59)歲，年齡范圍為59～78歲。患者的納入標(biāo)準(zhǔn)為[5]：(1)符合糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)及分類標(biāo)準(zhǔn)；且其他臨床癥狀不典型，主要表現(xiàn)為高血糖；(2)患者生活自理，沒(méi)有嚴(yán)重的并發(fā)癥；(3)所有患者均自愿配合本次調(diào)查。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥，如酮癥酸中毒、嚴(yán)重糖尿病腎病等；(2)合并有嚴(yán)重甲亢、肺結(jié)核惡性腫瘤患者；(3)存在有精神病陽(yáng)性家族史或個(gè)人史、有嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙等無(wú)法配合護(hù)理指導(dǎo)的情況，或者不愿意隨訪的患者。本研究獲咸陽(yáng)市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將觀察組患者分為觀察Ⅰ組(n=30)和觀察Ⅱ組(n=30)，其中觀察Ⅰ組患者中包括男性18例，女性12例，年齡(62.40±2.59)歲，年齡范圍為59～78歲，病程(5.90±0.89)年，病程范圍為4～8年，使用胰島素劑量為(38.99±2.34) U·d-1，舒張壓(79.99±1.56) mmHg，收縮壓(140.10±2.44) mmHg，血肌酐(99.02±2.52) μmol·L-1; 觀察Ⅱ組患者中包括男性19例，女性11例，年齡(61.72±2.44)歲，年齡范圍為56～75歲，病程(5.21±0.79)年,病程范圍為4～8年，使用胰島素劑量為(39.1±2.50) U·d-1，舒張壓(78.41±1.33) mmHg，收縮壓(138.87±2.12) mmHg，血肌酐(98.33 ±2.65) μmol·L-1。經(jīng)比較，兩組患者的基線資料(性別、年齡、病程、血肌酐等)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法觀察Ⅰ組患者予以常規(guī)的降糖治療，包括健康的飲食指導(dǎo)、生活方式指導(dǎo)、口服降糖藥(除二甲雙胍和胰島素增敏藥)、皮下注射胰島素等。觀察Ⅱ組患者在常規(guī)治療基礎(chǔ)上予以阿托伐他汀藥物(北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)141148)20 mg，每天1次，晚間口服，連服3個(gè)月。

1.3TRL4的檢測(cè)方法靜脈采血1 mL于ED-TA抗凝管。取100 μL抗凝血，再將10 μL加到TRL4抗體，混勻后避光孵育30 min，再裂解紅細(xì)胞，離心后細(xì)胞沉淀即加0.5 mL PBS重懸，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)單核細(xì)胞toll樣受體4表達(dá)；采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)檢測(cè)單核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)，采用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物，由日本Takara生物技術(shù)有限公司合成。引物序列(上海申友公司合成)。擴(kuò)增產(chǎn)物取每個(gè)反應(yīng)體系10 μL于非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳,電泳結(jié)果與β-actin的電泳結(jié)果相對(duì)照,得出TLR4表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。TRL4：上游CCATTTCAGCTCTGCCTTCAC 下游ACAACAATCACCTTTGGGCTTT。

1.4血清因子的檢測(cè)方法采用ELISA法分別測(cè)定血清超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6) 、總膽固醇(TC)、 低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等水平。試劑盒購(gòu)于武漢生物工程有限公司，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5觀察指標(biāo)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)單核細(xì)胞toll樣受體4表達(dá)；IL-6使用GC-911y計(jì)數(shù)儀測(cè)定，TNF-α與炎性反應(yīng)密切相關(guān)，其濃度與病情的嚴(yán)重程度成正比，使用GC-911y計(jì)數(shù)儀測(cè)定，hs-CRP為肝臟合成，釋放到血液中，常于炎性反應(yīng)期水平增高，其水平的高低直接影響疾病的發(fā)生，使用C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定。同時(shí)，對(duì)患者的治療前后的血糖進(jìn)行比較。其中血糖達(dá)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)為：空腹血糖5～6 mmol·L-1，餐后2 h血糖6～8 mmol·L-1，糖化血紅蛋白6.5%～7.0%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩組之間差異的比較使用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1對(duì)照組和觀察組患者的單個(gè)核細(xì)胞TRL4mRNA和蛋白表達(dá)比較較對(duì)照組而言，觀察組的單個(gè)核細(xì)胞TRL4 mRNA和蛋白表達(dá)治療后明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組和觀察組患者的單個(gè)核細(xì)胞TRL4 mRNA和蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組治療后比較

2.2觀察Ⅰ組和觀察Ⅱ組治療前后的TRL4mRNA和蛋白表達(dá)比較與治療前相比，治療后觀察Ⅰ組患者的單個(gè)核細(xì)胞TRL4 mRNA和蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而觀察Ⅱ組患者治療后的單個(gè)核細(xì)胞TRL4 mRNA和蛋白表達(dá)較治療前明顯降低，且更低于觀察Ⅰ組患者(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 A組和B組治療前后的TRL4 mRNA和蛋白表達(dá)比較

注：與觀察Ⅰ組組治療后相比，aP<0.05

2.3觀察Ⅰ組和觀察Ⅱ組治療前后的炎癥因子水平比較與治療前相比，治療后觀察Ⅰ組患者的hs-CRP、 TNF-α、IL-6 、TC、 LDL-C差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而觀察Ⅱ組患者治療后的hs-CRP、 TNF-α、IL-6 、TC、 LDL-C較治療前明顯降低，且更低于觀察Ⅰ組患者(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.4觀察Ⅰ組和觀察Ⅱ組治療前后的血糖指標(biāo)比較兩組治療前后的空腹血糖、餐后2 h血糖和糖化血紅蛋白情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組組間的比較也差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 觀察Ⅰ組和觀察Ⅱ組治療前后的血糖指標(biāo)比較

2.5糖尿病疾病組相對(duì)表達(dá)與血清因子的相關(guān)性TRL4與病情活動(dòng)的指標(biāo)相關(guān)，見(jiàn)表5。

表5 糖尿病疾病組相對(duì)表達(dá)與血清因子的相關(guān)性

3 討論

2型糖尿病的發(fā)病分別有遺傳、肥胖、年齡和現(xiàn)代生活方式等幾大因素相關(guān)，該疾病的治療主要以控制血糖為主[6-7]。而目前，在臨床中已有研究證明[8]，炎癥亦在與2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的影響作用。其中，急性和慢性高血糖通過(guò)多種信號(hào)參與2型糖尿病患者機(jī)體的炎性反應(yīng)[9]。所以，在對(duì)2型糖尿病患者進(jìn)行有效的降糖治療外，再進(jìn)行抗炎亦是治療此疾病的有效舉措之一。

表3 觀察Ⅰ組和觀察Ⅱ組治療前后的炎癥因子水平比較

注：與觀察Ⅰ組治療后相比，aP<0.05

相關(guān)文獻(xiàn)顯示[10]，單核細(xì)胞toll樣受體4信號(hào)通路和2型糖尿病的炎性反應(yīng)具有相關(guān)性。因氧化應(yīng)激，糖基化反應(yīng)的存在，患者外周血中和外周血單核細(xì)胞中的TLR4配體增加，TLR4與之結(jié)合后，誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生。炎癥的激活與TLR4高表達(dá)相關(guān)[11]。既往研究表明,2 型糖尿病患者TLR4表達(dá)增高,與血漿TNF-α呈正相關(guān),Devaraj等[12]報(bào)道1型糖尿病大鼠，TLR4表達(dá)上調(diào)與炎癥因子增加密切相關(guān)。TLR4缺陷的大鼠鏈脲佐 菌素誘導(dǎo)發(fā)生糖尿病后,TLR 下游分子 MyD88,磷酸化 IRAK-1 蛋白,Trif,IRF3,和 NF-κB 活性明顯下降,血清炎癥因子IL-1β,IL-6, MCP-1) 和 TNF-α降低。可見(jiàn)降低TLR4表達(dá)和抑制TLR4信號(hào)通路可能會(huì)減輕2型糖尿病的炎性反應(yīng)。陳海英等[13]的報(bào)道中顯示，2型糖尿病患者單細(xì)胞TLR4表達(dá)與血清炎癥因子CRP和TNF-α等相關(guān)。羅成等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠TLR4表達(dá)與炎癥因子亦具有相關(guān)性，TLR4缺陷的大鼠發(fā)生糖尿病后，其炎癥因子亦隨之降低。而在本研究發(fā)現(xiàn)，與健康的對(duì)照組相比，發(fā)生2型糖尿病患者的TRL4 mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，與以上文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似。由此說(shuō)明了TLR4信號(hào)通路的激活和介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在2型糖尿病的機(jī)體中發(fā)揮了重要作用。

近年來(lái)，他汀類藥物被臨床中廣為使用。他汀類藥物降低糖尿病患者心血管風(fēng)險(xiǎn)不能單用血脂降低解釋。他汀類藥物具有調(diào)脂外的多向性作用，其臨床獲益可能與抗炎作用相關(guān)。有研究證明[15]，他汀類藥物可以降低健康人群的TRL4表達(dá)和下游信號(hào)分子，但其在糖尿病患者中能否發(fā)揮抗炎的效果和是否與抑制TRL4通路相關(guān)尚未確定。而在本研究中的結(jié)果顯示，通過(guò)阿托伐他汀進(jìn)行治療的2型糖尿病患者的TRL4 mRNA和蛋白表達(dá)、CRP、TNF-α、IL-6、LDL-C等因子明顯降低，此外，本研究經(jīng)相關(guān)性結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，TRL4與CRP、TNF-α、IL-6、LDL-C間具有相關(guān)性，這說(shuō)明了阿托伐他汀在一定程度上降低糖尿病患者TRL4蛋白表達(dá)，進(jìn)而降低TRL4通路激活介導(dǎo)的炎性介質(zhì)產(chǎn)生，且可以起到有效的抗炎效果，同時(shí)，此發(fā)揮的作用和TRL4信號(hào)通路的抑制具有密切的關(guān)聯(lián)。所以，我們認(rèn)為可將TRL4信號(hào)通路和炎癥因子作為評(píng)估2型糖尿病患者疾病情況和嚴(yán)重度以及療效的有利指標(biāo)。同時(shí)，本研究中發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可以以輔助調(diào)節(jié)患者的糖代謝和控制血糖，由表4可以看出，B組的血糖指標(biāo)比A組和干預(yù)前的改善更為顯著。

綜上所述，阿托伐他汀的機(jī)制與TRL4及炎癥因子的釋放相關(guān)，這可能成為有效治療2型糖尿病治療作用的機(jī)制之一，且TRL4信號(hào)通路亦可能成為治療2型糖尿病的潛在靶點(diǎn)。