周林宗，徐文博，楊申明*

(1.楚雄師范學(xué)院 地理科學(xué)與旅游管理學(xué)院，云南 楚雄 675000；2.楚雄師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000)

毛頭鬼傘(Copyinds comatus)別名毛鬼傘、雞腿蘑、刺蘑菇，它屬鬼傘科(Coprinaceae)、鬼傘屬(Coprinus)，是一種分布較廣的食用菌，它屬大型真菌[1]。在我國各省區(qū)均有種植，菇體白色，單生或叢生，未開傘前狀如雞腿，又稱其為"刺蘑菇"，它的子實體富含蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、維生素和微量元素，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值[2-3]。但目前對毛頭鬼傘多糖的提取及抗氧化性的研究報道相對較少，本研究采用微波輔助法從毛頭鬼傘中提取多糖，通過單因素實驗優(yōu)化微波輔助提取毛頭鬼傘菇多糖的提取條件，并就所提取的毛頭鬼傘多糖對1,1-苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基和羥基自由基的清除作用進行初步研究，以期為毛頭鬼傘多糖的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

毛頭鬼傘，采于云南省楚雄市，經(jīng)鑒定為鬼傘屬鬼傘科毛頭鬼傘(Copyinds comatus)；葡萄糖標(biāo)準品(純度≥98%)，其他所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，水為實驗室自制超純水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-2100型紫外可見分光光度計，G80F23CN3P-Q5型微波爐，CP214C型電子天平，HH-2型恒溫水浴鍋，SHZ-ⅢA型循環(huán)水式真空泵，202-00型電執(zhí)鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 供試材料的處理

將新鮮的毛頭鬼傘用超純水洗凈、切片風(fēng)干后，放入55 ℃烘箱中烘干，粉碎后過40目篩，得毛頭鬼傘干粉。再將毛頭鬼傘干粉用濾紙包好放入索氏提取中，加入石油醚(沸程30～60 ℃)冷浸36 h，然后將其置于水浴中回流提取，直到除去樣品中脂溶性色素后，取出樣品風(fēng)干至石油醚全部揮發(fā)，再將毛頭鬼傘干粉放入55 ℃烘箱中烘干，得去除色素的毛頭鬼傘干粉，備用。

1.2.2 多糖含量的測定

用葡萄糖作為標(biāo)準品，參考文獻[4]的方法，采用苯酚濃硫酸法測定毛頭鬼傘多糖的含量。所得線性回歸方程A=38.17274C-0.0013，相關(guān)系數(shù)R=0.9994。結(jié)果表明吸光度與葡萄糖質(zhì)量濃度具有良好的線性關(guān)系，因此，可用于毛頭鬼傘多糖含量測定。

多糖提取率(%)=C×N×V/M×100%

式中：C為根據(jù)回歸方程計算出的多糖濃度(mg/mL)；V為定容體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；M為去除色素的毛頭鬼傘樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 提取工藝單因素實驗

1.2.3.1料液比對毛頭鬼傘多糖提取率影響

準確稱取5份1.0000 g去除色素的毛頭鬼傘粉末樣品，分別置于100 mL錐形瓶中，加20、30、40、50、60 mL蒸餾水，將樣品置于微波爐中，在600W功率下處理60 s。提取完畢后冷卻抽濾。將濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，再精確移取溶液10 mL于50 mL容量瓶中定容。移取0.10 mL試液于10 mL比色管中，加1 mL 5%苯酚溶液，再加入5 mL濃硫酸邊加邊振蕩，放置10 min；在40℃水浴中顯色20 s，放置10min冷卻，在490 nm波長處，以試劑空白作參比測定吸光度，計算提取率。

1.2.3.2微波功率對毛頭鬼傘多糖提取的影響

準確稱取5份1.0000 g去除色素的毛頭鬼傘粉末樣品，分別置于100 mL錐形瓶中，加入40 mL蒸餾水，將樣品置于微波爐中，分別在200、400、600、800、1000 W功率下處理60 s。其他操作同1.2.3.1節(jié)，計算提取率。

1.2.3.3微波輻射時間對毛頭鬼傘多糖的提取影響

準確稱取5份1.0000 g去除色素的毛頭鬼傘粉末樣品，分別置100 mL錐形瓶中，加入40 mL蒸餾水，將樣品置于微波爐中，在600 W功率下分別處理20、30、40、50、60 s。其他操作同1.2.3.1節(jié)，計算提取率。

1.2.4 加樣回收率測定

取1.0 mL已測得毛頭鬼傘多糖提取率的樣品溶液，分別加入質(zhì)量濃度為0.1000 mg/mL葡萄糖對照液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按標(biāo)準曲線繪制方法測定吸光度，計算回收率。

1.2.5 毛頭鬼傘多糖含量的測定

準確稱取3份1.0000 g去除色素的毛頭鬼傘樣品，在料液比1∶40(g/mL)、微波功率600 W下分別提取60 s。其他操作同1.2.3.1節(jié)，計算平均提取率。

1.2.6 毛頭鬼傘多糖抗氧化性的測定

將微波輔助提取得到的毛頭鬼傘多糖溶液分別配制成0.004、0.008、0.012、0.016、0.020 mg/mL 5種質(zhì)量濃度，研究其抗氧化性。

1.2.6.1清除DPPH·能力測定

參照文獻[5]的方法測定毛頭鬼傘多糖溶液對DPPH·的清除能力。毛頭鬼傘多糖對DPPH·清除率計算公式為：

式中：Ac為不加毛頭鬼傘多糖溶液空白對照的吸光度；Ai為DPPH溶液加毛頭鬼傘多糖溶液的吸光度；Ab為無水乙醇加毛頭鬼傘多糖溶液的吸光度。

1.2.6.2清除·OH能力測定

參照文獻[6]的方法測定毛頭鬼傘多糖對·OH的清除能力。毛頭鬼傘多糖對·OH清除率計算公式為：

式中：A0為毛頭鬼傘多糖溶液的空白對照溶液的吸光度；AX為加過氧化氫毛頭鬼傘多糖溶液的吸光度；AX0為不加過氧化氫毛頭鬼傘多糖溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對毛頭鬼傘多糖提取影響

在微波功率600 W，微波時間60 s的條件下，考察料液比對毛頭鬼傘多糖提取效果的影響，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，料液比為1∶20～1∶40(g/mL)時，毛頭鬼傘多糖提取率隨提取溶劑用量的增大而增大，當(dāng)液料比增大到1∶40(g/mL)時，提取率達到最大為5.39 %；之后隨提取溶劑用量的繼續(xù)增大，毛頭鬼傘多糖提取率下降。這可能是溶劑用量影響有效成分浸出溶液的濃度差，從而影響原料內(nèi)部與外部之間提取成分的傳質(zhì)過程。在液料比較小時，短時間內(nèi)多糖的溶出就達到平衡，不利于多糖的進一步溶出，但液料比太大受溶解度的作用變小，且溶劑用量過多導(dǎo)致后續(xù)蒸發(fā)困難，而底物濃度過低使得提取得率呈現(xiàn)下降趨勢[7]。因此，確定適宜的料液比為1∶40(g/mL)。

圖1 液料比對毛頭鬼傘多糖提取效果的影響

2.1.2 微波功率對毛頭鬼傘多糖提取效果的影響

在料液比1∶40(g/mL)，微波時間60 s的條件下，考察微波功率對毛頭鬼傘多糖提取效果的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，微波功率為200～600 W時，毛頭鬼傘多糖提取率隨微波功率的增大而增大，當(dāng)微波功率增大到600 W時，提取率達到最大為5.37%；之后隨微波功率的繼續(xù)增大，毛頭鬼傘多糖提取率下降。出現(xiàn)這種趨勢的原因可能是當(dāng)微波時間一定時，微波功率升高，物料吸收的微波熱能隨之增加，有效促進植物細胞的破碎，溶出物質(zhì)增加；當(dāng)微波功率增加達到一定水平后，會引起多糖降解，多糖提取率反而減小[8]。因此，確定適宜的微波功率600 W。

圖2 微波功率對毛頭鬼傘多糖提取效果的影響

2.1.3 微波時間對毛頭鬼傘多糖提取效果的影響

在料液比1∶40(g/mL)，微波功率600 W的條件下，考察微波時間對毛頭鬼傘多糖提取效果的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，當(dāng)微波時間為40～60min時，毛頭鬼傘多糖的提取率隨微波時間的延長而增大，當(dāng)微波時間延長到60min時，提取率達到最大為5.41 %；之后隨微波提取時間的繼續(xù)延長，毛頭鬼傘多糖的提取率逐漸減小。出現(xiàn)這種趨勢的原因可能是在較短的時間內(nèi)微波對毛頭鬼傘細胞壁及細胞膜的破壞作用大，導(dǎo)致細胞物質(zhì)大量溶出，提取率顯著提高；另一方面隨著微波時間的延長，細胞中其他雜質(zhì)的溶出增加，使得多糖得率下降[9]。因此，確定適宜的微波提取時間60min。

圖3 微波時間對毛頭鬼傘多糖提取效果的影響

2.2 多糖平均提取率及回收率的測定結(jié)果

根據(jù)單因素實驗所確定的提取工藝條件對毛頭鬼傘中的多糖進行提取，并對其平均提取率及回收率進行測定。結(jié)果毛頭鬼傘多糖的平均提取率為5.40%，平均加樣回收率為98.76%，RSD值為0.73%，表明本實驗方法對毛頭鬼傘多糖提取率測量的準確度較高。

2.3 毛頭鬼傘多糖對DPPH·和·OH的清除作用

毛頭鬼傘多糖對DPPH·和·OH的清除作用如表1所示?？梢姡^鬼傘多糖對DPPH·和·OH都有清除作用，且清除能力隨著毛頭鬼傘多糖質(zhì)量濃度的增大而清除能力增大，即清除率與毛頭鬼傘多糖質(zhì)量濃度間存在一定量效關(guān)系。

表1 毛頭鬼傘多糖對DPPH·和·OH的清除作用

3 結(jié)論與討論

本實驗采用微波輔助提取毛頭鬼傘多糖，通過因素實驗得到微波輔助提取毛頭鬼傘多糖的條件為料液比1∶40(g/mL)，微波功率600 W，微波時間60 s，在該條件下測得毛頭鬼傘多糖的平均提取率為5.40%，加樣回收率為98.76%，RSD值為0.73%。該提取方法操作簡單、重復(fù)性好、回收率高，是一種較為理想的提取毛頭鬼傘多糖的方法，可為毛頭鬼傘多糖的提取提供依據(jù)。

本研究從清除DPPH·和·OH的能力2個方面測定了毛頭鬼傘多糖的抗氧化性。試驗結(jié)果表明，毛頭鬼傘多糖對DPPH·和·OH具有較強的清除作用，在多糖質(zhì)量濃度為0.0040～0.020 mg/mL范圍內(nèi)，對DPPH·和·OH的清除率分別達到76.28%和54.24%，說明所提取的毛頭鬼傘多糖具有較強的抗氧化性。毛頭鬼傘多糖有望開發(fā)成天然抗氧化劑應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)，為毛頭鬼傘多糖的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，毛頭鬼傘多糖具有較強的抗氧化活性，相關(guān)研究結(jié)果對毛頭鬼傘多糖的提取及抗氧化活性成分的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。但由于本研究僅對微波輔助提取的毛頭鬼傘多糖進行抗氧化性測定，而采用微波輔助提取是否會影響毛頭鬼傘多糖多糖生物活性尚未知曉，因此在后續(xù)的試驗中可對不同提取方法與活性之間的關(guān)系進行深入研究。