王明珠，羅莉，蔡祥勝

(1.西安市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710004；2.廣東藥科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510080)

抗子宮內(nèi)膜抗體(EMAb)是造成女性不孕的常見(jiàn)原因[1]。正常位置的子宮內(nèi)膜對(duì)機(jī)體無(wú)抗原性，但異常位置的子宮內(nèi)膜可以作為抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)[2],常見(jiàn)于子宮內(nèi)膜異位癥患者。其產(chǎn)生的條件與異位內(nèi)膜刺激以及免疫失調(diào)等因素相關(guān)，另外和生殖道的炎癥反應(yīng)等因素也相關(guān)[3]。抗子宮內(nèi)膜抗體會(huì)引發(fā)子宮內(nèi)膜產(chǎn)生抗原抗體免疫反應(yīng)，在子宮內(nèi)產(chǎn)生局部免疫反應(yīng)，刺激機(jī)體的補(bǔ)體系統(tǒng)，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜發(fā)生病理性損傷[4]。破壞子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，影響內(nèi)膜發(fā)育和內(nèi)分泌功能[5]。子宮中營(yíng)養(yǎng)胚胎的糖原水平降低，免疫復(fù)合物的水平升高，導(dǎo)致受精卵的著床失敗以及胚胎發(fā)育不良，從而引起不孕或流產(chǎn)[6-7]?？棺訉m內(nèi)膜抗體針對(duì)的抗原為孕激素依賴蛋白(PAEP)、S100P和Nidogen-1等蛋白[8-9]。目前臨床檢測(cè)EMAb主要采用酶聯(lián)免疫法吸附(ELISA)方法。ELISA影響因素多，不能確定抗體結(jié)合部位。子宮內(nèi)膜抗原需從組織勻漿中提取，不僅組織來(lái)源困難而且也難于分離到高純度的蛋白。另外抗原成分復(fù)雜，特異性差，檢測(cè)批間差異較大。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)一種由多個(gè)蛋白的抗原表位組成的重組多表位子宮內(nèi)膜抗原，使用原核分泌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)[10-12]，并將其應(yīng)用于蛋白芯片檢測(cè)抗子宮內(nèi)膜抗體。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.大腸桿菌DH5α(dlacZDeltaM15DeltalacZYA-argFU169recA1endA1hsdR17(rK-mK+)supE44thi-1gyrA96relA1)用于重組質(zhì)粒擴(kuò)增。大腸桿菌YK537 (supE44hsdRhadMrecA1phoA8leuB6thilacYrpsL20galK2ara-14xyl-5mlt-1) 用于目的蛋白表達(dá)。PhoA質(zhì)粒用于構(gòu)建表達(dá)載體。菌株與質(zhì)粒均為廣東藥科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科贈(zèng)與。

2.血清樣本：選取2015年1月至2017年8月在西安市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心因不孕就診的71例患者，收集血清?；颊吣挲g23～39歲，平均年齡(31.6±2.3)歲；排除因生殖器官病變以及病毒感染引起的不孕癥患者。

二、主要試劑和儀器

內(nèi)切酶NheI和BamHI、質(zhì)粒提取試劑盒(大連寶生物)，Ni-NTA His-Bind Resin親和層析柱(Merck，德國(guó))，Biodot-AD1510點(diǎn)樣儀(BioDot，美國(guó))，酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.目的基因合成和表達(dá)載體構(gòu)建：使用DNASTAR軟件于子宮內(nèi)膜相關(guān)的PAEP、S100P和Nidogen-1序列分析抗原表位，設(shè)計(jì)新的人重組子宮內(nèi)膜(rhEM)多肽抗原序列，在不改變氨基酸序列的條件下，合成重組子宮內(nèi)膜抗原序列質(zhì)粒pGEM-T-EM和引物模版(上海生工生物)。引物序列以pGEM-T-EM為模版擴(kuò)增目的片段，引物序列為：rhEM-F：5′-GGTGGTGCTAGCGCTCAGAAGGGTAAACGTAACACCTTCC-3′，rhEM-R：5′-GGTGGTGGATCCGGTTTTGGTTTTAGAGTCTTTTTGG-3′。PCR產(chǎn)物和載體pGEM-T經(jīng)過(guò)酶切連接并進(jìn)行擴(kuò)增，隨后酶切鑒定。目的片段和PhoA分別用NheI和BamHI酶切后連接，膠純化后連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，于含氨芐青霉素LB平板中培養(yǎng)，挑克隆于5 ml LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后，提質(zhì)粒酶切鑒定，將陽(yáng)性克隆送測(cè)序(圖1)。

2.rhEM蛋白在YK537中表達(dá)：挑取PhoA-EM/YK537單菌落于5 ml LB培養(yǎng)基37℃，振搖培養(yǎng)過(guò)夜。收集菌并轉(zhuǎn)移到低磷培養(yǎng)基[低磷培養(yǎng)基為每100 ml培養(yǎng)基中含蛋白胨1 g，酵母浸膏0.25 g，MgSO4·7 H2O 0.05 g，1 mol/L Tris-Cl(pH 8.0)5 ml，苯酚紅0.2 ml，葡萄糖1 g]培養(yǎng)10 h后，離心收集沉淀，然后重懸至1 000 ml TSE溶液中(20 mmol/L Tris-Hcl，pH 7.0，20%葡萄糖，1 mmol/L EDTA)。冰浴30 min后，5 000 rpm離心，收集沉淀并棄去上清。之后將沉淀重懸至1 000 ml的TE溶液中(20 mmol/L Tris-Hcl，pH 7.0，1 mmol/L EDTA)，收集上清保存于-20℃準(zhǔn)備下一步純化。

3.rhEM抗原蛋白分離與純化：將收集的上清通過(guò)Ni-NTA His-Bind Resin進(jìn)行親和層析柱純化。蛋白稀釋于含0.2 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中并進(jìn)行SDS-PAGE分析。

4.rhEM抗原蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，免疫印記和高效液相色譜法(HLPC)分析鑒定：純化后的重組EM抗原蛋白通過(guò)12% SDS-PAGE電泳和免疫印記(Western blot)鑒定。按照Bio-rad電轉(zhuǎn)儀操作方法進(jìn)行，首先剪硝酸纖維膜(PVDF膜)適當(dāng)大小，泡甲醇20 min，然后同濾紙及海綿墊一起泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。按照黑板-海綿墊-3層濾紙-PAGE膠-PVDF膜-3層濾紙-海綿墊-白板的順序，將膠固定好，黑板對(duì)著轉(zhuǎn)移槽的黑板，黑板一邊放置冰盒，將轉(zhuǎn)移槽放在冰浴中200 mA，轉(zhuǎn)膜90 min后，將PVDF膜取出用0.01 M PBS漂洗，加5%脫脂奶粉封閉2 h。然后將1∶100封閉液稀釋的羊抗人的6His單抗點(diǎn)到PVDF膜上，4℃濕盒中孵育過(guò)夜。第二日，取出PVDF膜用PBS洗膜10 min，洗2次。室溫下與結(jié)合有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的兔抗羊的二抗(1∶200)孵育90 min。用含0.05% Tween 20的PBST洗膜10 min，洗2次，再用PBS洗膜10 min。將PVDF膜在二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液中顯色，至印記帶出現(xiàn)后，用H2O終止顯色。按廠家操作說(shuō)明步驟對(duì)目的蛋白進(jìn)行HPLC鑒定(貝克曼，美國(guó))。

5.蛋白芯片檢測(cè)方法的建立以及臨床應(yīng)用：采用棋盤法(0.3 mol/L包被緩沖、0.2% 甘油、0.01% Triton X-100和1.5%甘露醇)確定包被芯片的EM抗原濃度。此外，通過(guò)2倍連續(xù)稀釋法優(yōu)化所需血清濃度。采用Biodot-AD1510點(diǎn)樣儀將EM抗原稀釋液點(diǎn)樣到蛋白芯片上。蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)過(guò)程如下：室溫下PBS緩沖液沖洗芯片5 min，用紙巾拍干芯片，添加75 μl 10倍稀釋的血樣到每個(gè)孔，置于恒溫?fù)u床(37℃，150 r)孵育30 min。接下來(lái)，加入75 μl 結(jié)合HRP的單抗，將芯片放入搖床(37℃，150 rpm)振搖30 min。將芯片取出用PBST沖洗。晾干芯片。采用市售常用抗子宮內(nèi)膜抗體ELISA檢測(cè)試劑盒(廣州康遂生物)并根據(jù)產(chǎn)品操作說(shuō)明檢測(cè)抗子宮內(nèi)膜抗體。用蛋白芯片和ELISA方法檢測(cè)了71份不孕癥患者血清標(biāo)本。

結(jié) 果

一、rhEM蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)的建立

重組EM的基因序列位置于phoA質(zhì)粒中堿性磷酸酶信號(hào)序列下游，通過(guò)phoA中堿性磷酸酶啟動(dòng)子就可以控制蛋白的表達(dá)。多抗原表位的重組蛋白EM序列與表達(dá)質(zhì)粒連接后成功轉(zhuǎn)入表達(dá)載體YK537。rhEM蛋白片段約500 bp(圖2)。

圖1 phoA載體和rhEM的構(gòu)建示意圖

A.rhEM的PCR鑒定電泳圖，M：marker，1：rhEM蛋白的基因片段，大小約500bp；B.雙酶切鑒定電泳圖，M：marker，1：phoA和rhEM的雙酶切產(chǎn)物圖2 PCR和酶切鑒定rhEM基因和phoA載體

二、rhEM蛋白的表達(dá)和純化

rhEM蛋白的重組通過(guò)宿主菌YK537分泌表達(dá)。攜帶phoA質(zhì)粒的宿主菌株在30 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)12 h，將質(zhì)粒重組EM蛋白分泌到周質(zhì)腔。18 h后，重組蛋白約占總蛋白的20%(圖3A)。達(dá)到最大生產(chǎn)重組EM抗原20 mg/L的產(chǎn)量。

通過(guò)TSE溶液抽提后，接著使用Ni-NTA His-Bind樹(shù)脂純化rhEM抗原蛋白。大多數(shù)rhEM蛋白緊密結(jié)合的Ni-NTA His-Bind樹(shù)脂。0.4 mol/L咪唑洗脫含有大部分rhEM蛋白，純度約為90%。將0.4 M咪唑溶液洗脫的液體混合，超濾濃縮后，進(jìn)一步使用分子篩層析柱進(jìn)行分離(圖3B)。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和高效液相色譜分析中顯示，rhEM蛋白純度均達(dá)到95%以上(圖3C、D)。免疫印跡法確定了一條強(qiáng)染色條帶為rhEM蛋白(圖3E)。

三、蛋白質(zhì)芯片和ELISA兩種方法檢測(cè)抗子宮內(nèi)膜抗體

分別用市售常用檢測(cè)抗子宮內(nèi)膜抗體ELISA檢測(cè)試劑盒和本研究的蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)71例不明原因不孕患者。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)到陽(yáng)性樣本21份，50份樣本呈陰性。蛋白質(zhì)芯片鑒定陽(yáng)性23份，陰性品48份(圖4)。ELISA試劑盒與蛋白芯片檢測(cè)結(jié)果的符合率為96.2%，陽(yáng)性符合率為91%，陰性符合率為96%。用蛋白芯片法檢出陽(yáng)性血清23份(陽(yáng)性率為32%)；ELISA檢出9份陽(yáng)性血清(陽(yáng)性率為30%)(表1)?？偟膩?lái)說(shuō)，比較兩種方法，分別用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析評(píng)價(jià)，受試者工作曲線下面積(AUC)分別為蛋白質(zhì)芯片的0.89和ELISA的0.96(圖5)，表明蛋白芯片的檢測(cè)性能與ELISA法檢測(cè)不孕不育患者的相似。

A.rhEM蛋白在YK537中表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖。M：Marker，1：未攜帶質(zhì)粒的YK537，2：在發(fā)酵罐中培養(yǎng)12h，3：誘導(dǎo)蛋白表達(dá)前，4：誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后；B.親和層析后SDS-PAGE電泳圖，1：周質(zhì)腔抽提，2、3：鎳柱親和層析；C.分子篩層析后SDS-PAGE電泳結(jié)果；D.高效液相色譜結(jié)果；E.Western blot結(jié)果圖3 重組子宮內(nèi)膜抗原的表達(dá)與純化

A.抗子宮內(nèi)膜抗體陰性結(jié)果；B.抗子宮內(nèi)膜抗體陽(yáng)性結(jié)果圖4 蛋白芯片檢測(cè)結(jié)果

ELISA蛋白芯片+-總數(shù)+ 15823- 64248總數(shù) 215071

曲線下面積分別為蛋白芯片0.89，ELISA 0.96圖5 受試者工作曲線(ROC曲線)

討 論

對(duì)于免疫不孕患者，不育相關(guān)抗體的檢測(cè)越來(lái)越受到臨床的重視[13]?？棺訉m內(nèi)膜抗體的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致受精卵的著床失敗以及胚胎發(fā)育不佳，進(jìn)而引起不孕或者流產(chǎn)[14]。檢測(cè)抗子宮內(nèi)膜抗體對(duì)于診斷和治療有重要意義。目前文獻(xiàn)所報(bào)道的不育抗體陽(yáng)性率差別很大，其中一個(gè)重要原因是現(xiàn)在所采用的子宮內(nèi)膜抗原制備方法仍比較粗糙，常用子宮內(nèi)膜組織研磨后提取蛋白作為抗原成分制備檢測(cè)試劑盒。導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果一致性較差。本研究使用的重組子宮內(nèi)膜抗原，通過(guò)大腸桿菌分泌表達(dá)，抗原蛋白純度高，能減少天然提取時(shí)無(wú)法避免的干擾，以重組子宮內(nèi)膜抗原蛋白制備的蛋白芯片使不同批次間檢測(cè)結(jié)果的差異最小化，結(jié)果更為可信。

大腸桿菌表達(dá)蛋白由于其簡(jiǎn)便易行和低成本的優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成為常用的生物工程技術(shù)，而蛋白表達(dá)的關(guān)鍵在于保持其生物活性[15]。一般情況下，蛋白是以可溶還是包涵體形式存在，都表達(dá)于胞漿內(nèi)，必須經(jīng)過(guò)超聲波破碎菌體后才能使蛋白釋放出來(lái)，不但對(duì)蛋白本身有破壞作用，而且也增加了純化的難度與成本[16]。在本研究中使用信號(hào)肽使重組子宮內(nèi)膜蛋白分泌到大腸桿菌周質(zhì)腔，優(yōu)點(diǎn)在于使蛋白處于有利于二硫鍵形成和提高可溶性的環(huán)境，且不需要破菌提純，大大簡(jiǎn)化提純步驟并提高產(chǎn)量。為抗體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化提供了基礎(chǔ)。再加上蛋白芯片檢測(cè)技術(shù)高通量，高靈敏，所需上樣量小等特點(diǎn)，將會(huì)給不孕抗體的檢測(cè)提供更多技術(shù)選擇[17]。

目前，仍缺少檢測(cè)不孕相關(guān)抗體的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究利用蛋白芯片檢測(cè)結(jié)果與市售常用的ELISA比較，結(jié)果顯示蛋白芯片和ELISA檢測(cè)不孕癥患者抗子宮內(nèi)膜抗體基本符合。盡管如此，我們還需要進(jìn)行更深入的研究，通過(guò)不斷地優(yōu)化抗原和改進(jìn)工藝，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗子宮內(nèi)膜抗體的準(zhǔn)確診斷。