雷鑫，李弘，任文娟，惠董娜，劉建榮

(山西省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，太原 030012)

卵母細(xì)胞質(zhì)量極大的影響了人類(lèi)輔助生殖技術(shù)的臨床結(jié)局，尤其顯著的表現(xiàn)在種植率和胚胎發(fā)育[1-4]。在臨床過(guò)程中，卵母細(xì)胞評(píng)估主要是細(xì)胞內(nèi)和胞漿外的形態(tài)特征，比如，第一極體的形態(tài)，卵周隙的大小及顆粒，透明帶有無(wú)缺損，形態(tài)有無(wú)異常，折光體、致密細(xì)胞顆粒以及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集體(smooth endoplasmic reticulum aggregates，SERa)的存在[5]。在人類(lèi)輔助生殖中，經(jīng)促排卵體外獲得的卵母細(xì)胞中，有SERa形成者占有一定比例，這些卵母細(xì)胞最終發(fā)展為非整倍體的比例較高，影響隨后胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局。本文回顧分析我中心行常規(guī)體外受精(IVF)后含SERa卵母細(xì)胞的形成及其對(duì)胚胎發(fā)育的影響。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2014年1月至2017年7月在山西省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行常規(guī)IVF的313個(gè)周期(聯(lián)合IVF/ICSI周期不包含在本次研究中)，根據(jù)受精拆除顆粒細(xì)胞后是否可見(jiàn)SERa，分為SERa+周期組和SERa-周期組，前者是指至少有一個(gè)SERa+卵母細(xì)胞，后者是指沒(méi)有一個(gè)SERa+卵母細(xì)胞。比較兩組之間患者年齡、不孕年限、GnRH總量及使用時(shí)間、注射HCG日E2、LH、P水平及獲卵數(shù)、正常受精率、D3優(yōu)胚率的差異。

二、方法

1.促排卵與取卵：按照文獻(xiàn)[6]報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)臨床方案進(jìn)行促排與監(jiān)測(cè)。卵巢刺激使用人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG，麗珠制藥)聯(lián)合卵泡刺激素(FSH，果納芬，雪蘭諾，瑞士)。促性腺激素的劑量依照患者的年齡，第3天血清FSH值和竇卵泡數(shù)量來(lái)個(gè)體化決定。當(dāng)有3個(gè)或者更多優(yōu)勢(shì)卵泡達(dá)到17～18 mm時(shí)，使用5 000～10 000 U的人絨毛膜促性腺激素(HCG，麗珠制藥)進(jìn)行扳機(jī)。取卵在HCG注射之后34～36 h后進(jìn)行。

2.受精、胚胎培養(yǎng)及形態(tài)觀察：在取卵后3～6 h內(nèi)完成受精。受精后16～20 h拆除顆粒細(xì)胞，在200×倒置顯微鏡下觀察原核情況及細(xì)胞形態(tài)。受精后體外培養(yǎng)72 h，全程培養(yǎng)液采用Quinn’s Advantage(SAGE，美國(guó))。

3.SERa的判斷：卵母細(xì)胞受精后拆除周?chē)@的顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有一部分異常卵母細(xì)胞的存在，在高倍鏡下(200×)觀察可見(jiàn)胞質(zhì)中出現(xiàn)一些圓形、扁平且清晰的盤(pán)狀物，該物質(zhì)為滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集體(SERa)(圖1)。

圖1 胞質(zhì)中出現(xiàn)SERa(→)的卵母細(xì)胞 (200×)

4.胚胎質(zhì)量的評(píng)估：評(píng)估卵裂期胚胎形態(tài)，需要參照以下內(nèi)容：卵裂球的數(shù)目，均勻程度，碎片的多少，是否有多核的存在，透明帶和細(xì)胞質(zhì)是否有殘缺。卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：D3胚胎 8～10細(xì)胞，碎片<15%，卵裂球均勻，沒(méi)有多核，細(xì)胞質(zhì)顆粒均勻，無(wú)內(nèi)容物，卵周隙無(wú)顆粒，透明帶無(wú)缺損。缺乏以上任何一項(xiàng)均不可判定為優(yōu)質(zhì)胚胎。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、SERa出現(xiàn)情況

在常規(guī)IVF 313個(gè)周期中，SERa+的周期28例(8.9%)。

二、SERa+患者的一般情況

在本中心28例SERa+中，女方年齡(29.6±1.0)歲，不孕年限(3.4±0.4)年。Gn總量(2 250.00±170.52)U，Gn使用時(shí)間(8.8±0.3)d。注射HCG日女方激素水平：E2(8 926.02±1 486.56)pmol/L，LH(2.25±0.53)U/L，P(1.76±0.47)nmol/L。

三、SERa+周期組與SERa-周期組患者一般及促排卵情況比較

比較兩組注射HCG日E2水平，Z=-2.241，SERa+周期組患者注射HCG日E2水平高于SERa-周期組患者E2水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而兩組患者年齡、不孕年限、Gn天數(shù)、Gn總量、注射HCG日LH水平及P水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 SERa+周期組與SERa-周期組患者一般及促排卵情況比較(-±s)

注：與SERa-周期組比較，*P<0.05

兩組獲卵數(shù)比較，Z=-3.576，SERa+周期組患者獲卵數(shù)高于SERa-周期組患者獲卵數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。比較兩組2PN率(Z=-5.793)和D3優(yōu)胚率(Z=-2.854)，SERa+周期組患者2PN率和D3優(yōu)胚率低于SERa-周期組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 SERa+周期組與SERa-周期組實(shí)驗(yàn)室情況的比較[(-±s)，n(%)]

注：與SERa-周期組比較，*P<0.05

討 論

在臨床實(shí)踐中，卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)和胞漿外的特征通常會(huì)對(duì)其質(zhì)量產(chǎn)生影響，進(jìn)而很大程度上影響人類(lèi)輔助生殖技術(shù)的成功率。據(jù)報(bào)道，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集體(SERa)就與胚胎發(fā)育及臨床療效有關(guān)[6]。

滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)廣泛分布的由膜構(gòu)成的扁囊、小管或小泡連接形成的連續(xù)的三維網(wǎng)狀膜系統(tǒng)[7]。與空泡不同，SER沒(méi)有填充液體，也沒(méi)有胞膜跟卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)分開(kāi)[8]。其主要作用是儲(chǔ)存和釋放Ca2+，引起受精時(shí)皮質(zhì)顆粒的胞吐作用，對(duì)卵母細(xì)胞的成熟和受精以及早期胚胎的發(fā)育起到非常關(guān)鍵的作用[9]。

Munaswamy等[10]的分析發(fā)現(xiàn)，ICSI中SERa發(fā)生率為13%。本研究分析顯示，在IVF周期，我中心的SERa+周期占比為8.9%?？赡芘c我中心實(shí)行長(zhǎng)時(shí)受精有關(guān)，有些SERa在雙原核出現(xiàn)前已經(jīng)消失，但它與第二極體釋放的先后順序目前尚不清楚。在本研究中發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞拆除顆粒細(xì)胞后SERa持續(xù)存在則意味著受精失敗，與早前time-lapse live embryo imaging觀察到的結(jié)果是一致的[5]。SERa的形成機(jī)制目前尚不明確。有一種假設(shè)，卵母細(xì)胞缺陷的顯現(xiàn)最終是由不恰當(dāng)?shù)穆殉泊碳ぴ斐傻?。本研究發(fā)現(xiàn)卵胞質(zhì)中 SERa的出現(xiàn)與患者年齡、不孕年限、Gn總量及使用時(shí)間、注射 HCG 日血LH、P水平無(wú)關(guān)，而與注射 HCG 日血 E2水平有很大的相關(guān)性，所有SERa+周期組 患者都有較高 E2水平，這可能提示高 E2水平是引起 SERa 形成的重要原因。并且本研究發(fā)現(xiàn)，與SERa-周期組相比，SERa+周期組在獲卵數(shù)上顯著增加，說(shuō)明卵巢刺激不當(dāng)可能是SERa出現(xiàn)的原因。

SERa，作為一種細(xì)胞質(zhì)的畸形，有研究提出，在ICSI周期中，卵胞漿中出現(xiàn)SERa可顯著降低受精率、有效胚胎形成率進(jìn)而影響卵母細(xì)胞利用率[11]。而且，移植來(lái)自SERa+卵母細(xì)胞的胚胎可見(jiàn)畸形新生兒[12]。Beckwith-Wiedemann綜合征是其致病的一種畸形[13]。電鏡下可見(jiàn)SERa具有更多微小致病的結(jié)構(gòu)[13]。因此，認(rèn)為卵母細(xì)胞SERa的形成會(huì)導(dǎo)致各種異常出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)增加，因此應(yīng)該廢棄SERa+卵母細(xì)胞，并且要仔細(xì)檢查同一周期的卵母細(xì)胞[14]。然而，最近也有多項(xiàng)報(bào)道，含SERa的卵母細(xì)胞可以正常受精并獲得健康后代[15-16]。有一項(xiàng)針對(duì)13個(gè)相關(guān)研究的系統(tǒng)分析顯示，在SERa+周期中183個(gè)嬰兒已經(jīng)出生，其中171個(gè)是正常的，8個(gè)存在畸形，3個(gè)是死胎，1個(gè)夭折[17]。目前缺少對(duì)SERa卵母細(xì)胞評(píng)估的研究，其對(duì)子代的影響尚存爭(zhēng)議；具體對(duì)IVF周期中出現(xiàn)SERa的意義的研究尤為少見(jiàn)。本研究將本中心的28例SERa+的IVF周期與SERa-周期的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩組中2PN率、D3優(yōu)胚率存在顯著差異，分析可能是因?yàn)镾ERa形成影響了卵母細(xì)胞正常鈣儲(chǔ)存與鈣釋放，進(jìn)而影響了受精和胚胎發(fā)育[18]。Otsuki等[19]研究發(fā)現(xiàn)，SERa在消失之前直徑是不斷增長(zhǎng)的，該現(xiàn)象可能解釋了受精率下降的原因是由于體積較大的SERa限制了原核的形成。然而有些研究發(fā)現(xiàn)，在ICSI周期兩組的D3優(yōu)胚率卻是相似的[20]。至于為什么受精方式的不同導(dǎo)致優(yōu)胚率存在差異，目前并不是很清楚。研究[7]中發(fā)現(xiàn)，一些SERa+MII卵母細(xì)胞是可以避免異常鈣釋放，進(jìn)而發(fā)育成囊胚。提示SERa的尺寸、形態(tài)及出現(xiàn)的頻率等可能都是影響其胚胎發(fā)育和臨床結(jié)局的重要因素。Otsuki等[19]發(fā)現(xiàn)，直徑越小的SERa(比如2～5 μm)，沒(méi)有電鏡是不能觀察到的。提示我們可能會(huì)有一部分SERa陽(yáng)性的病例會(huì)被忽略，而且與接近卵母細(xì)胞中央體積較大的SERa相比，這些只位于卵胞漿皮層區(qū)域小的SERa是否具有同樣的危害目前并不清楚。

目前，SERa+卵母細(xì)胞是否應(yīng)該廢棄仍舊存在爭(zhēng)議。對(duì)于那些臨床助孕治療中獲得SERa+胚胎并且胚胎數(shù)目不足的患者，是否移植SERa+胚胎需要做更多的研究。SERa可能與基因印跡障礙疾病有關(guān)，提示來(lái)自同一周期的SERa+與SERa-卵母細(xì)胞是否應(yīng)該都廢棄。因此，考慮目前這些具有爭(zhēng)議性的數(shù)據(jù)以及可能存在的遺傳學(xué)問(wèn)題，是否移植被SERa影響的胚胎仍需要長(zhǎng)期的關(guān)注。