張宏展，熊風(fēng)，李觀貴，孫青，陳培林，萬才云，姚志鴻，鐘惠嫻，曾勇

(深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045)

胚胎冷凍解凍是人類輔助生殖技術(shù)(ART)中的一項(xiàng)重要延伸技術(shù)，依靠該技術(shù)實(shí)現(xiàn)胚胎的長(zhǎng)期保存，不僅能夠減少ART中藥物控制性促排卵的次數(shù)，充分利用一次促排卵獲得的所有胚胎，提高累積妊娠率；而且還為規(guī)避如內(nèi)膜容受性差、過度刺激風(fēng)險(xiǎn)高等不利移植時(shí)機(jī)提供可能，提高單次移植妊娠率[1-2]。因此，未移植的可用胚胎冷凍后保存數(shù)月或數(shù)年后，待適宜時(shí)機(jī)解凍再移植入母體子宮已經(jīng)是目前IVF-ET過程中的普遍做法，即胚胎移植前經(jīng)歷一次冷凍、一次解凍過程。在實(shí)際的臨床工作中，胚胎復(fù)蘇移植周期中會(huì)遇到一些特殊情況如患者突發(fā)陰道炎、急性感染、發(fā)熱等，導(dǎo)致已經(jīng)復(fù)蘇的胚胎無法移植入母體子宮，被迫對(duì)胚胎進(jìn)行重復(fù)玻璃化冷凍保存，后續(xù)再行二次解凍移植。本研究擬探討重復(fù)冷凍胚胎復(fù)蘇后的存活情況及移植后的臨床結(jié)局，實(shí)現(xiàn)更清楚的患者知情。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2013年1月至2017年9月于本院生殖科行重復(fù)玻璃化冷凍胚胎解凍的周期為研究對(duì)象，共收集卵裂期胚胎二次解凍周期39個(gè)，囊胚二次解凍周期18個(gè)。39個(gè)卵裂期胚胎解凍周期中，1個(gè)周期因胚胎溶解重新解凍其它胚胎移植，4個(gè)周期解凍后行囊胚培養(yǎng)未移植，10個(gè)周期與一次凍融胚胎混合移植，最終單純移植重復(fù)玻璃化卵裂期胚胎周期數(shù)24個(gè)。18個(gè)囊胚解凍周期中，1個(gè)周期因胚胎溶解取消移植，4個(gè)周期與一次凍融囊胚混合移植，最終單純移植重復(fù)玻璃化囊胚周期數(shù)13個(gè)。為了研究重復(fù)凍融胚胎移植后的臨床結(jié)局，本研究采用傾向性評(píng)分匹配的方法在同時(shí)期本科室單次凍融胚胎移植的患者中，依據(jù)女性患者的年齡、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)，按1∶3最近鄰匹配法，設(shè)定卡鉗值為0.03保證匹配結(jié)果的優(yōu)良性，進(jìn)行傾向性評(píng)分匹配，最終分別得到59個(gè)卵裂期移植周期和39個(gè)囊胚移植周期，作為對(duì)照組。對(duì)比分析兩組間的胚胎種植率、生化妊娠率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、活胎分娩率等臨床指標(biāo)。

二、方法

1.促排卵、受精和胚胎培養(yǎng)：促排卵均采用本科室常規(guī)促排方案，優(yōu)勢(shì)卵泡≥18 mm時(shí)，肌肉注射HCG(默克，德國(guó))，36 h后行陰道B 超穿刺取卵，39 h～41 h后加精受精或ICSI受精，精液優(yōu)化處理采用不連續(xù)密度梯度離心法。受精后放置于37℃，5% CO2、5%O2、90%N2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.胚胎評(píng)分與冷凍標(biāo)準(zhǔn)：將Peter卵裂期胚胎評(píng)分系統(tǒng)[3]結(jié)合本中心實(shí)際情況制定出D3卵裂期胚胎的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1級(jí)：卵裂球數(shù)目≥7個(gè)，碎片數(shù)量≤10%；2級(jí)：卵裂球數(shù)目≥7個(gè)，10%<碎片數(shù)量≤20%；3級(jí)：卵裂球數(shù)目≥7個(gè)，碎片數(shù)量>20%或5≤卵裂球數(shù)目<7個(gè)，碎片數(shù)量≤10%；4級(jí)：5≤卵裂球數(shù)目<7個(gè)，碎片數(shù)量>10%或卵裂球數(shù)目<5個(gè)。根據(jù)此評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，將1級(jí)、2級(jí)胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎，一般僅冷凍優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎。對(duì)于囊胚而言，根據(jù)Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，3期及3期以上且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層評(píng)分不含C的囊胚。

3.玻璃化冷凍與解凍：胚胎冷凍解凍程序采用玻璃化冷凍-快速解凍法。利用玻璃化冷凍/解凍液(SAGE，美國(guó))和Cryotop冷凍載體(Kitazato，日本)進(jìn)行卵裂期胚胎冷凍/解凍。冷凍及解凍步驟嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。重復(fù)玻璃化為玻璃化冷凍的胚胎解凍后又再次進(jìn)行玻璃化冷凍。卵裂期胚胎復(fù)蘇后卵裂球數(shù)目≥冷凍胚胎卵裂球數(shù)目一半定義為存活，囊胚復(fù)蘇后囊胚腔擴(kuò)張，細(xì)胞未坍陷瓦解為存活。

4.內(nèi)膜準(zhǔn)備與胚胎移植：對(duì)于月經(jīng)周期正常且排卵規(guī)律的患者采用自然周期方案，即根據(jù)陰道超聲監(jiān)測(cè)，月經(jīng)天數(shù)≥10 d，優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥14 mm，子宮內(nèi)膜達(dá)到7～8 mm以上，排卵后D3進(jìn)行卵裂期胚胎、D5進(jìn)行囊胚移植。月經(jīng)周期不正常或排卵不規(guī)律的患者采用人工周期方案，即月經(jīng)D3起口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，拜爾，德國(guó))4 mg/d×5 d，根據(jù)內(nèi)膜情況調(diào)整劑量及天數(shù)。15 d后B超監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜厚度7～8 mm以上時(shí)，肌肉注射黃體酮(浙江仙琚制藥)60 mg/d至移植日。B超介導(dǎo)下行胚胎移植術(shù)。

5.黃體支持及妊娠判斷：自移植次日改用黃體酮凝膠(默克，德國(guó))90 mg/d置于陰道，直至取卵后 16 d抽血查β-HCG。移植后30 d，B超下見到妊娠囊及原始心管搏動(dòng)判為臨床妊娠，宮內(nèi)妊娠則行黃體支持至12周。

6.傾向性評(píng)分匹配：SPSS 24.0安裝相應(yīng)的R插件和psmatching 3.spe，在SPSS菜單中成功生成PS Matching模塊后，按照黃福強(qiáng)等[4]介紹的方法，依據(jù)女方年齡、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)，采用1∶3最近鄰匹配法、設(shè)定卡鉗值為0.03保證匹配結(jié)果的優(yōu)良性，最終獲得與實(shí)驗(yàn)組協(xié)變量均衡的對(duì)照組樣本。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，百分率的差異性分析采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05定義為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、重復(fù)玻璃化冷凍胚胎復(fù)蘇情況

本研究共收集卵裂期胚胎重復(fù)冷凍解凍周期39個(gè)，解凍胚胎57枚，存活55枚，復(fù)蘇存活率為96.49%；囊胚重復(fù)冷凍解凍周期18個(gè)，復(fù)蘇胚胎24枚，存活23枚，復(fù)蘇存活率95.83%。

二、兩組患者基本資料比較

實(shí)驗(yàn)組卵裂期胚胎移植周期和囊胚移植周期的女方年齡、平均移植胚胎數(shù)、平均移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、內(nèi)膜準(zhǔn)備過程中的黃體轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度分別與對(duì)照組卵裂期胚胎和囊胚移植周期相比，基本特征均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組移植患者基本資料比較(-±s)

三、移植后臨床結(jié)局比較

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，無論在卵裂期胚胎移植周期中還是在囊胚移植周期中，兩組各項(xiàng)指標(biāo)均呈現(xiàn)相類似的變化趨勢(shì)，即實(shí)驗(yàn)組胚胎移植后種植率、HCG陽性率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、活胎分娩率等臨床結(jié)局與對(duì)照組的單次凍融胚胎移植后的結(jié)局無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組患者移植后臨床結(jié)局比較[(%)]

注：1部分移植周期截至投稿時(shí)尚未到隨訪日期;21個(gè)周期生產(chǎn)結(jié)局失訪。

討 論

ART的快速發(fā)展，胚胎冷凍解凍技術(shù)在輔助生殖中的應(yīng)用越來越廣泛，尤其是玻璃化冷凍方法，自1998 年[5]首次報(bào)道成功妊娠以來，在全世界迅速被推廣應(yīng)用。所謂玻璃化是指液態(tài)的物質(zhì)在一定的降溫速率下，由液相直接轉(zhuǎn)變成為一種玻璃狀的固體狀態(tài)的過程，內(nèi)部沒有晶體結(jié)構(gòu)。對(duì)于保存胚胎的溶液，無冰晶的玻璃化狀態(tài)，能保持溶液內(nèi)的分子和離子分布，阻止了冷凍和解凍過程中溶液在液態(tài)和晶體形態(tài)之間來回轉(zhuǎn)換，從而避免了冰晶形成對(duì)胚胎的物理化學(xué)損傷，獲得更好的冷凍效果[6]。在實(shí)際應(yīng)用中，玻璃化冷凍技術(shù)也確實(shí)獲得良好的效果。大量的文獻(xiàn)研究表明，玻璃化技術(shù)的應(yīng)用對(duì)胚胎及子代都是相對(duì)安全的[7-8]，玻璃化法冷凍胚胎出生兒也日益增多。然而，畢竟玻璃化冷凍方法是一種非自然狀態(tài)下胚胎經(jīng)歷的人工體外操作方法，其實(shí)施過程中高濃度冷凍保護(hù)劑的毒性作用、體外操作可能引起的胚胎細(xì)胞物理損傷或功能損傷、潛在的病原微生物污染等問題都可能影響胚胎的種植潛能[9-10]。尤其是對(duì)胚胎進(jìn)行反復(fù)凍融，可能對(duì)胚胎產(chǎn)生損傷的幾率更大，影響移植的種植潛能及移植后的臨床結(jié)局。

目前已有的對(duì)胚胎反復(fù)凍融的研究樣本主要是在不同發(fā)育階段進(jìn)行冷凍，如殷寶莉等[11]分析了玻璃化冷凍復(fù)蘇的第3天卵裂期胚胎培養(yǎng)至囊胚后再行二次凍融移植，結(jié)果顯示二次凍融囊胚周期與單次凍融囊胚周期相比，臨床妊娠率顯著下降，據(jù)此認(rèn)為多次凍融可能影響胚胎發(fā)育潛能。2006年Sheehan等[12]采用冷凍環(huán)(cryoloop)法對(duì)小鼠胚胎在2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、囊胚期冷凍，研究結(jié)果表明，玻璃化操作并不影響小鼠胚胎發(fā)育形成8細(xì)胞期及囊胚期，甚至對(duì)移植后的種植潛能和新生鼠仔的體重?zé)o顯著性差異。與上述不同，本研究關(guān)注的患者是同一階段(卵裂期或囊胚期)連續(xù)二次凍融，中間幾乎未曾經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間體外培養(yǎng)發(fā)育的過程。為了探討這種連續(xù)二次凍融對(duì)胚胎種植及移植后臨床結(jié)局的影響，本文對(duì)2013年1月至2017年9月經(jīng)歷重復(fù)冷凍解凍的57個(gè)周期(39個(gè)囊胚解凍周期和18個(gè)卵裂期胚胎解凍周期)進(jìn)行回顧性分析。結(jié)果表明，復(fù)蘇重復(fù)玻璃化卵裂期胚胎57枚，復(fù)蘇存活率為96.49%；解凍重復(fù)玻璃化囊胚24枚，存活率為95.83%。與目前報(bào)道的玻璃化冷凍方法的復(fù)蘇存活率大致相當(dāng)[13]，鑒于本中心一般僅冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎，而優(yōu)質(zhì)胚胎本身玻璃化冷凍的效果良好[14]，因此，對(duì)于經(jīng)歷一次凍融的胚胎再行重復(fù)凍融在技術(shù)上是可行的。

為了進(jìn)一步探討重復(fù)凍融胚胎的種植潛能和移植后的臨床結(jié)局，我們從上述解凍周期中去除混合移植的周期數(shù)，最終收集了24個(gè)完全移植重復(fù)玻璃化凍融卵裂期胚胎和13個(gè)完全移植重復(fù)玻璃化凍融囊胚周期，同時(shí)相應(yīng)的以同時(shí)期條件相當(dāng)?shù)囊浦矄未蝺鋈谂咛ト巳鹤鳛閷?duì)照。分析過程中，為了保證兩組樣本量以及基礎(chǔ)資料的均衡，本研究引入了傾向性評(píng)分匹配法[15]，傾向性評(píng)分法相當(dāng)于一個(gè)事后隨機(jī)化的過程，其優(yōu)勢(shì)在于能夠?qū)⒉煌M間傾向性評(píng)分相近的個(gè)體匹配出來，均衡組間混雜因素的分布，減少處理效應(yīng)估計(jì)的偏倚[16]。我們采用1∶3最近鄰匹配法、設(shè)定卡鉗值為0.03，匹配了女性患者年齡、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)3個(gè)影響臨床妊娠結(jié)局的關(guān)鍵因素后[17-18]，得到兩組間協(xié)變量相對(duì)均衡的對(duì)照組樣本，從而使分析的結(jié)果盡可能的真實(shí)和可靠[19]。

本研究的分析結(jié)果顯示，無論在卵裂期胚胎移植周期中還是在囊胚移植周期中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比各項(xiàng)指標(biāo)均呈現(xiàn)相類似的變化趨勢(shì)，即實(shí)驗(yàn)組胚胎移植后種植率、HCG陽性率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、活胎分娩率等臨床結(jié)局與對(duì)照組的單次冷凍解凍胚胎移植后的結(jié)局無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，也提示在患者年齡、平均移植胚胎數(shù)、平均移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)平衡的條件下，重復(fù)玻璃化凍融對(duì)胚胎的種植及移植后臨床結(jié)局并無顯著影響。2011年Schlenker等[20]對(duì)染色體篩查(comprehensive chromosome screening，CCS)患者囊胚移植結(jié)果的研究也表明，經(jīng)歷玻璃化凍融-活檢-玻璃化凍融-移植之后種植率與單次凍融的整倍體囊胚移植結(jié)局相當(dāng)(62.2%vs.63.6%)，移植后的臨床妊娠率為76.2%(16/21)。雖然本研究中的種植率和臨床妊娠率，都明顯低于Schlenker等[20]的研究，這主要是由于其數(shù)據(jù)來源于篩選后的整倍體囊胚的移植結(jié)局。但是，兩個(gè)研究結(jié)果同樣都提示重復(fù)凍融胚胎移植后的種植率及臨床妊娠率與單次凍融胚胎無顯著差異，其原因一方面可能與玻璃化冷凍解凍技術(shù)的發(fā)展成熟有關(guān)，另一方面也與樣本中大多數(shù)重復(fù)凍融胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎有關(guān)，優(yōu)質(zhì)胚胎耐受降溫和復(fù)溫?fù)p傷能力相對(duì)較強(qiáng)[21]。當(dāng)然，受收集樣本的局限，本研究結(jié)果仍需要更大樣本量的隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。