雷萍，石艷艷，羅紅權(quán)，吳雨露，李寧，張麗萍

(四川省婦幼保健院檢驗(yàn)科，成都 610045)

B族鏈球菌(GBS)為革蘭陽(yáng)性兼性厭氧球菌，主要寄生在人體下消化道及泌尿生殖道。GBS為條件致病菌，孕產(chǎn)婦和新生兒感染的主要細(xì)菌之一，亦可導(dǎo)致具有基礎(chǔ)疾病及免疫力低下人群的機(jī)會(huì)性感染[1]。孕婦GBS感染可引起胎膜早破、流產(chǎn)、早產(chǎn)、絨膜羊膜炎、宮內(nèi)感染、胎兒生長(zhǎng)受限、孕產(chǎn)婦敗血癥和產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎等，可通過(guò)垂直傳播引起新生兒肺炎、敗血癥、腦膜炎等[2-3]。但國(guó)內(nèi)對(duì)于孕婦GBS感染尚無(wú)統(tǒng)一且規(guī)范的干預(yù)指南，且有研究認(rèn)為孕婦GBS感染不會(huì)影響妊娠結(jié)局。我科根據(jù)多年的婦科經(jīng)驗(yàn)顯示，孕婦GBS篩查及早期干預(yù)對(duì)母兒具有重要意義。

目前篩查GBS的常用方法有細(xì)菌培養(yǎng)、特異性抗原或抗體測(cè)定、核酸探針檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。細(xì)菌培養(yǎng)法是診斷GBS感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)長(zhǎng)，且孕婦生殖道中存有多種細(xì)菌，在普通培養(yǎng)基中GBS生長(zhǎng)受到抑制，易造成漏診；GBS抗原或抗體檢測(cè)可短時(shí)間內(nèi)獲得結(jié)果，但假陰性率和假陽(yáng)性率高；PCR檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高?？焖佾@得準(zhǔn)確GBS結(jié)果，對(duì)孕期未進(jìn)行GBS篩查而在臨產(chǎn)時(shí)來(lái)院分娩的孕婦尤其重要。本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)孕婦GBS感染的臨床效能，分析了孕婦GBS感染對(duì)妊娠結(jié)局的影響。

材料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2015年1月至2016年12月在本院孕婦保健并住院初次分娩的單胎孕婦共3 565例，孕35～37周，年齡23～39歲。根據(jù)孕婦意愿，將帶GBS的孕婦分為2個(gè)組，愿意接受干預(yù)治療的設(shè)為干預(yù)治療組，按CDC“圍生期GBS預(yù)防指南(2010)”[4]，實(shí)行產(chǎn)時(shí)抗生素預(yù)防和治療，對(duì)用藥有顧忌不愿接受干預(yù)治療的設(shè)為未干預(yù)治療組。

排除標(biāo)準(zhǔn)：非陰道分娩；取材前1月內(nèi)患感染性疾病，全身或陰道局部使用過(guò)抗菌素。

本課題經(jīng)院倫理委員會(huì)同意，所有受試孕婦或家屬均簽署知情同意書(shū)。

二、主要儀器與試劑

LightCycler2.0實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(羅氏，德國(guó))，VITEK2 Compact微生物鑒定系統(tǒng)(梅里埃，法國(guó))；GBS-DNA提取試劑和擴(kuò)增試劑盒(北京博爾誠(chéng)科技)；CAMP蛋白的基因設(shè)計(jì)特異引物、熒光探針、核酸制備及擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒(福建泰普生物)；BACT9120全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)(BD，美國(guó))；菌種鑒定采用API鑒定系統(tǒng)(中國(guó)生物梅里埃)。

三、方法

1.標(biāo)本采集：擦去外陰分泌物后，將1根無(wú)菌拭子插入陰道下1/3，旋轉(zhuǎn)1周采取陰道分泌物，同時(shí)采集2根拭子，2根拭子置于1個(gè)無(wú)菌套管內(nèi)作為1份標(biāo)本，密閉；將1根無(wú)菌拭子插入肛門(mén)，于肛門(mén)括約肌上2～3 cm處輕旋轉(zhuǎn)，采取直腸分泌物，同時(shí)采集2根拭子，2根拭子置于1個(gè)無(wú)菌套管內(nèi)作為1份標(biāo)本，密閉。標(biāo)本采集后1 h內(nèi)送檢。經(jīng)孕婦本人知情同意。

2.GBS培養(yǎng)：按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第4版)。陰道和直腸拭子接種血瓊脂平皿，在5%～10%CO2環(huán)境下35℃孵育24～48 h。挑取血平皿上有β溶血的菌落進(jìn)行CAMP試驗(yàn)，并采用VITEK2 compact微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GBS-DNA：對(duì)GBS編碼CAMP蛋白的基因設(shè)計(jì)特異引物和熒光探針。核酸制備、擴(kuò)增檢測(cè)及陰陽(yáng)性結(jié)果判斷嚴(yán)格試劑盒說(shuō)明書(shū)。

4.GBS帶菌者判定[5]：直腸分泌物和陰道分泌物任一檢出GBS都確定為帶菌者。培養(yǎng)出GBS即判定為GBS帶菌者；GBS培養(yǎng)陰性而PCR陽(yáng)性者，則再采集陰道和直腸分泌物做第2次GBS培養(yǎng)和DNA檢測(cè)，培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法任意一項(xiàng)陽(yáng)性即判定為GBS帶菌者；第1次或第2次標(biāo)本GBS培養(yǎng)和PCR均陰性判定為未攜帶GBS者。

直腸/陰道定植率=(直腸/陰道分泌物檢出GBS人數(shù))/總?cè)藬?shù)100%。

5.新生兒細(xì)菌感染檢測(cè)：收集所有新生兒的血標(biāo)本，采用BACT9120全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)，菌種鑒定采用API鑒定系統(tǒng)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、孕婦GBS攜帶率

3 565例孕婦確診為GBS攜帶者352例，帶菌率為9.87%。

二、不同年齡孕婦GBS攜帶率比較

隨著孕婦年齡增加，GBS帶菌率有增加趨勢(shì)，但不同年齡組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 各年齡段孕婦帶菌率[n(%)]

三、標(biāo)本采集部位比較

352例GBS帶菌者中，陰道分泌物檢出率[40.63%(143/352)]低于直腸分泌物檢出率[86.93%(306/352)](P<0.05)；GBS在陰道的定植率[4.01%(143/3 565)]高于直腸[8.58%(306/3 565)](P<0.05)。

四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)孕婦GBS感染的比較

135例患者細(xì)菌培養(yǎng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR均陽(yáng)性，3 191均為陰性，6例培養(yǎng)陽(yáng)性而實(shí)時(shí)熒光定量PCR陰性，233例培養(yǎng)陰性而實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性(表2)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果

五、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)GBS的臨床效能

與細(xì)菌培養(yǎng)法比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)第1次標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果診斷GBS感染的靈敏度(SEN)、特異性(SPE)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(+PV)、陰性預(yù)測(cè)值(-PV)、陽(yáng)性似然比(+LR)和準(zhǔn)確度均較高，陰性似然比(-LR)較低(表3)。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法與培養(yǎng)法檢測(cè)GBS的臨床效能(%)

六、各組孕婦不良妊娠結(jié)局的比較

胎膜早破、早產(chǎn)、宮內(nèi)感染、胎兒窘迫和新生兒感染的發(fā)生率，未干預(yù)治療組顯著高于GBS陰性組和干預(yù)治療組(P<0.05)，而干預(yù)治療組與GBS陰性組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表4)。

表4 各組孕婦不良妊娠的發(fā)生率[n(%)]

注：與其他兩組比較，*P<0.05

七、各組新生兒感染病原檢查

各組均出現(xiàn)不同程度的GBS、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等感染，未干預(yù)治療組發(fā)生GBS感染數(shù)顯著增高(P<0.05)，而干預(yù)治療組與GBS陰性組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；其余菌種感染各組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表5)。

表5 各組新生兒感染病原檢查[n(%)]

注：與GBS陰性組比較，*P<0.05

討 論

各種菌群共處于陰道微生態(tài)環(huán)境中并保持平衡狀態(tài)，即陰道微生態(tài)平衡。GBS為女性生殖道常見(jiàn)細(xì)菌，妊娠期體內(nèi)雌激素和孕激素水平升高、糖原含量增加、陰道pH值改變及免疫功能低下，可能是引起陰道菌群失調(diào)，GBS繁殖增加[6]。本研究結(jié)果顯示，晚期孕婦陰道直腸GBS帶菌率為9.87%，低于歐美國(guó)家孕婦陰道直腸的帶菌率10%～35%[7]，與國(guó)內(nèi)孕婦的帶菌率5%～15%[8]一致。流行病學(xué)調(diào)查顯示，歐美孕婦GBS帶菌率高于亞洲孕婦[9]。GBS的檢出率受多種因素影響，如人種、地域、年齡、檢測(cè)方法、取材部位和取材時(shí)間等[2，8]。本研究結(jié)果顯示，20～40歲孕婦的GBS帶菌率與年齡無(wú)關(guān)，與文獻(xiàn)[9-11]報(bào)道一致；直腸分泌物GBS檢出率顯著高于陰道分泌物，可見(jiàn)兩種標(biāo)本聯(lián)合檢測(cè)可提高GBS的檢出率。

GBS對(duì)特殊人群如孕婦、新生兒有較強(qiáng)的致病性。妊娠期GBS感染的危害遠(yuǎn)高于非妊娠人群。GBS通過(guò)產(chǎn)道上行擴(kuò)散感染子宮和胎膜，使帶菌孕婦易發(fā)生晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎膜早破、絨毛羊膜炎和產(chǎn)褥感染等，其中早產(chǎn)和流產(chǎn)發(fā)生與GBS感染可引起磷脂酶A、前列腺素和炎癥因子等大量釋放有關(guān)[12]。妊娠期GBS感染可通過(guò)母嬰垂直或水平傳播至胎膜，通過(guò)炎性細(xì)胞的吞噬作用和蛋白水解酶的直接入侵，使胎膜局部張力減少，導(dǎo)致產(chǎn)前發(fā)生胎膜破裂、合并宮內(nèi)感染，發(fā)生新生兒肺炎、腦膜炎和敗血癥等疾病[8，13]。本研究顯示，未干預(yù)治療的GBS帶菌孕婦人群的胎膜早破、早產(chǎn)、宮內(nèi)感染、胎兒窘迫和新生兒感染的發(fā)生率顯著高于GBS陰性組和干預(yù)治療組，而干預(yù)治療組與GBS陰性組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與文獻(xiàn)報(bào)道[9，14-15]一致，提示晚期孕婦GBS感染可危害孕婦和胎兒或新生兒的健康，在產(chǎn)程過(guò)程中對(duì)GBS感染孕婦給予抗菌素預(yù)防和治療可有效降低不良妊娠發(fā)生率。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，GBS陽(yáng)性組的胎膜早破、早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)窘迫和新生兒感染的發(fā)生率與陰性組間并無(wú)顯著性差異[16]，這也是部分妊娠期GBS感染孕婦不接受治療的原因之一。本研究中三組孕婦均存在不同程度的新生兒GBS感染，未干預(yù)治療組發(fā)生GBS感染數(shù)明顯增高，而干預(yù)治療組與GBS陰性組的新生兒GBS感染數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示GBS也可通過(guò)母嬰途徑傳染給新生兒，而給予藥物干預(yù)可有效抑制GBS自母親傳至新生兒。但3 213例GBS陰性組的仍有8例GBS感染的新生兒，提示GBS陰性組中至少有8例孕婦為GBS假陰性，可能與GBS感染具有潛伏性及間歇性的特點(diǎn)相關(guān)，但仍需要更多研究數(shù)據(jù)考察。

本研究顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)孕婦GBS感染的靈敏度和特異性為98.30%和99.50%，與文獻(xiàn)報(bào)道[8，17]基本一致。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一定程度影響了結(jié)果判斷，假陽(yáng)性率較高，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)間短，符合產(chǎn)前和產(chǎn)時(shí)的篩查要求；少數(shù)GBS感染孕婦細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)缺乏溶血環(huán)而誤判為陰性，此時(shí)可以采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR定性。

本研究中有6例細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性而實(shí)時(shí)熒光定量PCR陰性，這可能是因?yàn)镚BS為革蘭陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁有較厚的肽聚糖層，細(xì)菌難于裂解[18]，或細(xì)菌核酸樣品中有實(shí)時(shí)熒光定量PCR抑制劑；16例非GBS帶菌者實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性，這可能是因?yàn)闃?biāo)本間交叉污染。由此可見(jiàn)，對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)，標(biāo)本處理與核酸制備很重要。對(duì)于采用兩種方法均未檢出的GBS感染，可能與GBS感染具有潛伏性及間歇性有關(guān)。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種快速準(zhǔn)確篩查妊娠晚期GBS的方法。妊娠晚期孕婦GBS感染會(huì)導(dǎo)致胎膜早破、早產(chǎn)、宮內(nèi)感染、胎兒窘迫和新生兒感染的發(fā)生率升高，及時(shí)采取干預(yù)措施可有效降低不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。