韓瑞才 蘇如奇 萬(wàn)建林 龍啟樟 曾勇軍 潘曉華 石慶華 吳自明,*

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高溫脅迫下黃嘌呤脫氫酶基因超表達(dá)對(duì)水稻幼苗的保護(hù)作用

韓瑞才1蘇如奇1萬(wàn)建林2龍啟樟2曾勇軍1潘曉華1石慶華1吳自明1,*

(1江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/雙季稻現(xiàn)代化生產(chǎn)協(xié)同中心，南昌 330045；2江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所，南昌 330200；*通訊聯(lián)系人，E-mail：wuzmjxau@163.com)

【目的】黃嘌呤脫氫酶(xanthine dehydrogenase, XDH)是嘌呤代謝的關(guān)鍵酶。通過分析高溫脅迫對(duì)超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻株系幼苗葉片生理指標(biāo)的影響，探究XDH緩解水稻高溫脅迫的生理機(jī)制。【方法】以超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(和)及受體品種日本晴(WT)為材料，研究了高溫脅迫對(duì)水稻幼苗葉片葉綠素含量、相對(duì)含水量、可溶性蛋白含量、活性氧代謝、抗氧化酶活性、XDH活性及嘌呤代謝產(chǎn)物尿囊素(allantoin)和尿囊酸(allantoate)含量等生理指標(biāo)的影響?！窘Y(jié)果】高溫脅迫處理前，超表達(dá)株系的葉綠素含量、相對(duì)含水量、可溶性蛋白含量、活性氧代謝及抗氧化酶活性等生理指標(biāo)均與野生型無顯著差異；高溫脅迫5 d，超表達(dá)株系的葉綠素、相對(duì)含水量、可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性均高于野生型，而過氧化氫(H2O2)及丙二醛(MDA)的含量顯著低于野生型；適溫恢復(fù)生長(zhǎng)5 d，野生型和超表達(dá)株系的葉綠素含量、相對(duì)含水量及可溶性蛋白含量均有所提高，超表達(dá)株系均高于野生型，H2O2和MDA的含量降低，超表達(dá)株系均低于野生型；受高溫誘導(dǎo)超表達(dá)株系與野生型中XDH酶活性及尿囊素和尿囊酸的含量均提高，且在整個(gè)處理過程中超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系均高于野生型。【結(jié)論】XDH通過調(diào)控酰脲類物質(zhì)的合成，補(bǔ)償自身的抗氧化能力并增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，從而有效提高水稻幼苗對(duì)高溫脅迫的耐受能力。

水稻；黃嘌呤脫氫酶；高溫脅迫；生理機(jī)制

水稻起源于低緯度的熱帶地區(qū)，雖然形成了適應(yīng)高溫和短日照生態(tài)環(huán)境的特性，但水稻生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的適宜溫度范圍。近年來，全球氣候顯著變化，極端高溫天氣頻繁出現(xiàn)，高溫已成為威脅水稻安全生產(chǎn)的重要?dú)夂蛞蜃覽1,2]。高溫通過影響水稻的光合作用、抗逆系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、關(guān)鍵酶類活性、內(nèi)源激素及部分代謝產(chǎn)物，阻礙水稻的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量的形成[3]。高溫發(fā)生在水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期會(huì)抑制地上部和地下部的生長(zhǎng)，發(fā)生葉鞘變白和失綠等癥狀，分蘗量降低，株高增速減緩[4,5]。抽穗揚(yáng)花期高溫脅迫極易導(dǎo)致花粉敗育和子房受精受阻，嚴(yán)重影響結(jié)實(shí)率[6]。灌漿期則縮短灌漿時(shí)間，降低同化產(chǎn)物積累量，秕谷增多，粒重降低，導(dǎo)致產(chǎn)量損失及品質(zhì)降低[7]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要通過調(diào)整栽培管理技術(shù)及利用化學(xué)調(diào)控等措施增強(qiáng)水稻抵御高溫的能力。隨著基因組學(xué)、分子生物學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科的發(fā)展，發(fā)掘作物抗高溫基因資源，利用常規(guī)育種及分子標(biāo)記育種培育耐高溫水稻品種成為目前的熱點(diǎn)研究方向。

黃嘌呤脫氫酶(xanthine dehydrogenase, XDH)是調(diào)控嘌呤代謝的關(guān)鍵酶，能夠催化黃嘌呤(xanthine)和次黃嘌呤(hypoxanthine)生成尿酸，后經(jīng)一系列代謝反應(yīng)，形成尿囊素和尿囊酸[8]。研究表明，XDH參與調(diào)控植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)。近年來，有學(xué)者對(duì)擬南芥[9]、豌豆[10]、玉米[11]、葡萄[12]等多種植物XDH參與調(diào)控非生物脅迫的生理機(jī)制進(jìn)行了研究，調(diào)控機(jī)理涉及活性氧代謝[13]、氮代謝[14]和激素代謝[15]等多項(xiàng)代謝進(jìn)程。然而，關(guān)于水稻XDH耐熱性的研究較少。本研究以超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系及受體品種日本晴(L.)為材料，研究高溫脅迫對(duì)葉綠素含量、相對(duì)含水量、可溶性蛋白含量、活性氧代謝、抗氧化酶活性、XDH酶活性及酰脲類物質(zhì)含量等生理指標(biāo)的影響，探索XDH緩解水稻苗期高溫脅迫的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料種植

以來源于不同愈傷組織的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(和)及其受體品種日本晴(WT)為供試材料，載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化均在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所萬(wàn)建民院士實(shí)驗(yàn)室完成。

試驗(yàn)在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。采用土培法，在人工光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行。人工培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)置如下：28℃/25℃(白天/夜晚)，光照周期為12 h光照/12 h黑暗，光照強(qiáng)度22 000 lx/0 lx(白天/夜晚)，相對(duì)濕度75%。將野生型及轉(zhuǎn)基因株系浸種催芽，播種于盆缽內(nèi)(盆缽內(nèi)徑8 cm×高10 cm)，每盆10粒，重復(fù)3次，每個(gè)材料共種植90盆，每個(gè)重復(fù)30盆。高溫處理前每盆精選5株生長(zhǎng)一致的幼苗進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。水稻幼苗第3片葉完全展開時(shí)進(jìn)行高溫處理，將培養(yǎng)箱溫度調(diào)至42℃/42℃(白天/夜晚)，脅迫處理5 d，隨后恢復(fù)正常溫度生長(zhǎng)5 d。于高溫處理前、高溫處理5 d時(shí)及適溫恢復(fù)生長(zhǎng)5 d，取最上部完全展開葉片測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 PCR及qPCR檢測(cè)

提取水稻基因組DNA，利用載體中的潮霉素抗性基因()對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR陽(yáng)性鑒定，所用引物為-F(5'-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC -3')和-R(5'-ATGCCTGAACTCACCGCGAC-3')。

采用qPCR的方法檢測(cè)超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中基因的表達(dá)量。按照植物總RNA提取試劑盒(天根)說明提取水稻葉片總RNA，利用NanoDrop ND2000超微量核酸蛋白分析儀對(duì)其濃度和質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。以提取的總RNA為模板，按照第一鏈cDNA合成試劑盒(天根)說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。利用染料法熒光定量試劑盒(Takara)在CFX96實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行qPCR檢測(cè)，目的基因引物為-qF(5'-ATGGGGTCGCTCACCAGGGC-3')和-qR(5'-TCCTGTTGAAGGGCGATAGGTCGG-3')，內(nèi)參引物為-qF(5'-GCTCCGTGGCGGTATCAT -3')和-qR(5'-CGGCAGTTGACAGCCC TAG-3')。

A－超表達(dá)載體結(jié)構(gòu)。LB為T-DNA左邊界，Hyg為潮霉素抗性篩選基因，35S為花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子，Ubi為ubiqutin基因啟動(dòng)子，Kpn I為酶切位點(diǎn)，RB為T-DNA右邊界。B－T2代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR陽(yáng)性鑒定。WT為野生型，1~16為16個(gè)隨機(jī)選取的T2代轉(zhuǎn)基因植株。C－轉(zhuǎn)基因植株OsXDH基因的表達(dá)量。xdh1為OsXDH超表達(dá)株系1，xdh5為OsXDH超表達(dá)株系5。數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)。**表示在0.01水平上差異極顯著(LSD)。

Fig. 1. Construction ofover-expression vector, PCR analysis ofgene in T2transgenic plants and expression analysis ofin over-expressed lines.

1.2.2 葉綠素、相對(duì)含水量及可溶性蛋白含量測(cè)定

用80%丙酮溶液提取葉綠素，采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定[16]；葉片相對(duì)含水量的測(cè)定按照張志良[17]的方法進(jìn)行；用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.0)提取可溶性蛋白，利用考馬斯亮藍(lán)比色法進(jìn)行測(cè)定[18]。

1.2.3 H2O2和MDA含量的測(cè)定

按Lin等[19]的方法測(cè)定H2O2含量；MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法[17]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 抗氧化酶活性的測(cè)定

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)及過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定均采用李合生等[18]的方法進(jìn)行。

1.2.5 XDH酶活性的測(cè)定

XDH酶活性的測(cè)定參照Sagi等[20]的方法?？扇苄缘鞍诐舛炔捎每捡R斯亮藍(lán)比色法進(jìn)行測(cè)定，而后進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量均為50μg。以次黃嘌呤為底物、氮藍(lán)四唑?yàn)轱@色劑將凝膠染色成像。利用灰度分析軟件ImageJ2x計(jì)算XDH酶的相對(duì)活性。

1.2.6 尿囊酸和尿囊素的測(cè)定

用80%乙醇提取尿囊酸和尿囊素，并參照Sagi等[20]的方法進(jìn)行測(cè)定。

A－葉綠素含量; B－可溶性蛋白含量; C－相對(duì)含水量。BS為高溫處理前，HTSFD為高溫處理5 d，PSRFD為高溫處理后適溫恢復(fù)生長(zhǎng)5 d。WT為野生型，xdh1為OsXDH超表達(dá)株系1，xdh5為OsXDH超表達(dá)株系5。數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)，*表示在0.05水平上差異顯著(LSD)。

Fig. 2. Effects of high temperature stress on chlorophyll content, soluble protein content and relative water content in rice leaves.

A－過氧化氫含量; B－丙二醛含量。BS 為高溫處理前; HTSFD 為高溫處理5 d; PSRFD 為適溫恢復(fù)生長(zhǎng)5 d。WT 為野生型; xdh1 為OsXDH 超表達(dá)株 系1; xdh5 為OsXDH 超表達(dá)株系5。數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)。*和**分別表示在0.05 和0.01 水平上顯著差異(LSD)。

A, H2O2 content; B, MDA content. BS, Before high temperature stress; HTSFD, High temperature stress for 5 days; PSRFD, Post-stress recovery for 5 days. WT, Wild type; xdh1, OsXDH over-expressed transgenic line 1; xdh5, OsXDH over-expressed transgenic line 5. Values are shown as mean±SD (n＝3).*and**, Significant difference at P<0.05 and P<0.01 levels by LSD, respectively.

圖3 高溫脅迫對(duì)水稻葉片過氧化氫含量和丙二醛含量的影響

Fig. 3. Effects of high temperature stress on H2O2 and Malondialdehyde(MDA) content in rice leaves.

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2007求得平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差及作圖，利用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用最小顯著極差法(LSD)進(jìn)行處理間顯著性檢驗(yàn)，顯著水平設(shè)定為顯著(0.05)與極顯著(0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsXDH超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的獲得和目的基因的表達(dá)分析

用RT-PCR擴(kuò)增基因完整編碼閱讀框，經(jīng)測(cè)序與NCBI網(wǎng)站上公布的基因序列完全一致。采用In-fusion技術(shù)將目的基因片段連入pCUbi1390載體，獲得超表達(dá)載體(圖1-A)。后經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化及T0~T2代PCR陽(yáng)性驗(yàn)證，獲得純合的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(圖1-B, C)。

2.2 高溫脅迫對(duì)OsXDH超表達(dá)株系相對(duì)含水量、葉綠素含量和可溶性蛋白含量的影響

高溫通過影響類囊體的物理化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)組織，導(dǎo)致細(xì)胞組分葉綠體的降解，進(jìn)而影響葉片的光合作用[21]。由圖2-A可知，在高溫脅迫處理前，超表達(dá)株系葉片的葉綠素含量與野生型無顯著差異；高溫脅迫使兩者的葉綠素含量降低，超表達(dá)株系顯著高于野生型；恢復(fù)適溫后，兩者葉片中的葉綠素含量回升，過表達(dá)株系高于野生型且仍處于顯著水平。

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能提高細(xì)胞的保水能力，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起保護(hù)作用[22]。由圖2-B可知，適溫條件下，超表達(dá)株系葉片的可溶性蛋白含量與野生型無顯著差異；高溫脅迫降低了兩者葉片中的可溶性蛋白含量，過表達(dá)株系高于野生型但差異不顯著；當(dāng)恢復(fù)適溫時(shí)，兩者的可溶性蛋白含量均升高且過表達(dá)株系顯著高于野生型。

A－超氧化物歧化酶活性; B－過氧化物酶活性; C－過氧化氫酶活性。BS為高溫處理前; HTSFD為高溫處理5 d; PSRFD為適溫恢復(fù)生長(zhǎng)5 d。WT為野生型; xdh1為OsXDH超表達(dá)株系1; xdh5為OsXDH超表達(dá)株系5。數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)。 *，**分別表示在0.05和0.01水平上顯著差異(LSD)。

Fig. 4. Effects of high temperature stress on activities of superoxide dismutase(SOD), peroxidase(POD) and catalase(CAT) in rice leaves.

溫度升高時(shí)，葉片的蒸騰作用加強(qiáng)，根系吸水能力降低，造成生理性缺水。由圖2-C可知，適溫時(shí)超表達(dá)株系的相對(duì)含水量與野生型無顯著差異；高溫降低了兩者的相對(duì)含水量，超表達(dá)株系的相對(duì)含水量顯著高于野生型；恢復(fù)適溫時(shí)兩者的相對(duì)含水量提高，過表達(dá)株系高于野生型且仍處于顯著水平。

2.3 高溫脅迫對(duì)OsXDH超表達(dá)株系H2O2和MDA含量的影響

高溫脅迫使植物體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)，促進(jìn)膜脂過氧化產(chǎn)生MDA，抑制保護(hù)酶活性并降低抗氧化物含量，加劇細(xì)胞損傷。由圖3可知，適溫時(shí)超表達(dá)株系和野生型葉片中的的H2O2和MDA的含量無顯著差異；高溫脅迫5 d后，野生型H2O2和MDA的含量顯著增加，過表達(dá)株系增量較小，兩者分別呈顯著和極顯著差異；恢復(fù)適溫后，超表達(dá)株系及野生型的H2O2和MDA含量均降低，野生型仍極顯著高于超表達(dá)株系。

2.4 高溫脅迫對(duì)OsXDH超表達(dá)株系抗氧化酶活性的影響

SOD可降低超氧陰離子和過氧化氫對(duì)植物自身膜系統(tǒng)的損傷。由圖4-A可知，高溫脅迫處理前，超表達(dá)株系與野生型中的SOD活性無顯著差異；高溫脅迫5 d，顯著高于野生型；適溫恢復(fù)5 d后，超表達(dá)株系的SOD活性極顯著高于野生型。

由圖4-B可知，高溫脅迫處理前，超表達(dá)株系與野生型中的POD活性無顯著差異；高溫脅迫5 d，超表達(dá)株系顯著高于野生型；適溫恢復(fù)5 d后，超表達(dá)株系POD活性均極顯著高于野生型。

如圖4-C所示，適溫時(shí)超表達(dá)株系與野生型中的CAT無顯著差異；高溫脅迫5 d，兩者的CAT活性均降低且超表達(dá)株系極顯著高于野生型；適溫恢復(fù)5 d，超表達(dá)株系與野生型間的差距持續(xù)增加，兩者仍存在極顯著差異。

BS為高溫處理前; HTSFD為高溫處理5 d; PSRFD為適溫恢復(fù)生長(zhǎng)5 d。WT為野生型; xdh1為OsXDH超表達(dá)株系1; xdh5為OsXDH超表達(dá)株系5。每條通道可溶性蛋白的上樣量均為50μg。以次黃嘌呤作為底物，條帶亮度為XDH酶相對(duì)活性。用軟件ImageJ2x分析條帶亮度，顯示酶活相對(duì)值。

Fig. 5. Effects of high temperature stress on xanthine dehydrogenase(XDH) activity in rice leaves.

2.5 高溫脅迫對(duì)OsXDH超表達(dá)株系XDH酶活性的影響

隨著對(duì)基因表達(dá)水平的調(diào)控及受高溫脅迫的誘導(dǎo)，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中的XDH酶活性也發(fā)生了相應(yīng)的變化(圖5)。高溫脅迫處理前，超表達(dá)株系和野生型XDH酶活性存在明顯的差異，超表達(dá)株系高于野生型；高溫脅迫5 d，超表達(dá)株系和野生型XDH酶活性均明顯提高，超表達(dá)株系的升幅高于野生型；適溫恢復(fù)生長(zhǎng)5 d后，超表達(dá)株系的酶活性降低，而野生型株系仍持續(xù)升高，且恢復(fù)生長(zhǎng)后的XDH酶活性仍高于高溫脅迫處理前；在整個(gè)處理過程中，超表達(dá)株系的XDH酶活性始終高于野生型。

2.6 高溫脅迫對(duì)OsXDH超表達(dá)株系嘌呤代謝產(chǎn)物尿囊素和尿囊酸含量的影響

由圖6可知，高溫脅迫處理前，野生型和超表達(dá)株系的尿囊素和尿囊酸含量均較低且超表達(dá)株系顯著高于野生型；高溫脅迫5 d后，野生型和超表達(dá)株系的尿囊素和尿囊酸含量均顯著上升且兩者間的差異進(jìn)一步擴(kuò)大；適溫恢復(fù)生長(zhǎng)5 d后，野生型和超表達(dá)株系的尿囊素和尿囊酸的含量均降低且超表達(dá)株系仍顯著高于野生型。

3 討論

溫度是影響水稻生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子，溫度過高或過低均不利于水稻的生長(zhǎng)。葉綠素是光合作用中能量轉(zhuǎn)化的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量是反映作物衰老狀況的一個(gè)重要指標(biāo)，對(duì)高溫適應(yīng)性強(qiáng)的水稻品種的葉綠素含量的下降幅度小于適應(yīng)差的品種[23]?？扇苄缘鞍兹菀资艿侥婢趁{迫因子的影響，是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量可以作為植物抗逆性的指標(biāo)[24]。水分是植物生存的先決條件，高溫造成的生理性缺水嚴(yán)重影響植物的正常生長(zhǎng)。本研究表明高溫脅迫及適溫恢復(fù)后超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系能夠保持較多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，細(xì)胞具有較強(qiáng)的保水性，能夠維持膜結(jié)構(gòu)及功能的相對(duì)穩(wěn)定，減輕高溫對(duì)細(xì)胞組分的損傷，提高水稻對(duì)高溫逆境的耐受能力。

根據(jù)生物自由基傷害學(xué)說[25]，外界逆境條件下造成的傷害就是細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除的不平衡所致，從而產(chǎn)生膜脂過氧化作用或膜脂脫脂化作用，形成丙二醛(MDA)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)受高溫脅迫影響，H2O2含量增加，過多的活性氧加劇了膜脂過氧化。與野生型相比，高溫下超表達(dá)株系由于積累的MDA含量較少，能夠更好地維持膜的結(jié)構(gòu)及功能，保證水稻幼苗正常的生理功能。同時(shí)H2O2作為重要的抗性誘導(dǎo)因子，能夠觸發(fā)植物細(xì)胞啟動(dòng)自我保護(hù)機(jī)制，產(chǎn)生過氧化保護(hù)酶來清除體內(nèi)的ROS，減少它們對(duì)膜脂的損傷，保持細(xì)胞正常的新陳代謝活動(dòng)[27]。當(dāng)遭遇嚴(yán)重脅迫時(shí)，體內(nèi)自由基含量增加，活性氧消除系統(tǒng)活性下降，植物自由基的“產(chǎn)生-消除”平衡受到破壞，進(jìn)而損害植物細(xì)胞和組織[28,29]。本研究表明高溫脅迫及適溫恢復(fù)后過表達(dá)株系保持了較高的抗氧化能力，減輕了H2O2的積累和膜脂過氧化程度。

研究表明，基因沉默引起嘌呤代謝水平改變，產(chǎn)生嘌呤代謝產(chǎn)物的缺陷可導(dǎo)致植株生長(zhǎng)延緩或其他不利表型的出現(xiàn)，而不是由于嘌呤本身的累積[30]。反之，若通過提高水稻基因的表達(dá)水平來增強(qiáng)XDH的酶活性，促進(jìn)嘌呤代謝下游產(chǎn)物的產(chǎn)生，是否有利于水稻植株的生長(zhǎng)？本研究表明，正常生長(zhǎng)條件下，雖然超表達(dá)株系和野生型苗期的XDH酶活性及其下游代謝產(chǎn)物的含量存在顯著差異，但并未在葉綠素含量、相對(duì)含水量、可溶性蛋白含量及氧化還原系統(tǒng)等生理指標(biāo)上有所表現(xiàn)，但當(dāng)處于高溫環(huán)境時(shí)，超表達(dá)株系與野生型的各生理指標(biāo)呈現(xiàn)顯著差異。Brychkova等[31]和Watanabe等[32]在研究擬南芥基因的作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在正常生長(zhǎng)條件下野生型和干擾株系在表型及生理指標(biāo)上均無明顯差異；相較于野生型，暗脅迫和干旱脅迫加劇了干擾株系細(xì)胞的死亡和葉片的損傷。由此我們可知正常生長(zhǎng)條件下野生型水稻幼苗中的嘌呤代謝產(chǎn)物可滿足自身的需求，代謝產(chǎn)物的過多積累對(duì)幼苗的生長(zhǎng)無明顯作用；當(dāng)受到高溫脅迫時(shí)，XDH酶活性的提高及嘌呤產(chǎn)物的積累可緩解高溫脅迫對(duì)水稻幼苗的損傷。

A－尿囊素含量; B－尿囊酸含量。BS為高溫處理前，HTSFD為高溫處理5 d，PSRFD為適溫恢復(fù)生長(zhǎng)5 d。WT為野生型，xdh1為OsXDH超表達(dá)株系1，xdh5為OsXDH超表達(dá)株系5。數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)。*，**分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著(LSD)。

Fig. 6. Effects of high temperature stress on allantoin and allantoate contents in rice leaves.

另有研究指出，嘌呤代謝的下游產(chǎn)物酰脲類物質(zhì)是一種有效的活性氧清除劑[33,34]，增加尿囊素和尿囊酸含量，能抵償ROS傷害和減少幼苗死亡[35]。水稻幼苗處于高溫環(huán)境時(shí)，會(huì)造成活性氧自由基的過度積累和XDH酶活性上調(diào)以及嘌呤代謝下游產(chǎn)物積累，而此時(shí)超表達(dá)株系表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化及耐高溫的能力。說明隨著氧化還原系統(tǒng)平衡的打破，XDH酶活性的上調(diào)以及酰脲類物質(zhì)的產(chǎn)生降低了活性氧自由基的積累，緩解了高溫對(duì)膜系統(tǒng)的損傷。同時(shí)有研究表明，高溫脅迫下水稻葉片中的抗氧化酶POD、SOD及CAT活性升高，但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)則活性下降[36]。高溫下超表達(dá)株系具有較高的抗氧化酶活性，說明在應(yīng)對(duì)嚴(yán)重高溫脅迫的調(diào)節(jié)過程中XDH酶活性的提高延緩了氧化保護(hù)酶類活性的降低。聯(lián)系嘌呤代謝產(chǎn)物具有清除活性氧的作用，說明通過增強(qiáng)XDH酶活性，提高嘌呤代謝水平，適當(dāng)補(bǔ)償自身的抗氧化能力，緩解高溫脅迫對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)的損傷，降低活性氧積累和膜脂的過氧化程度，是基因超表達(dá)增強(qiáng)水稻苗期耐受高溫脅迫的原因之一。

前人研究指出，XDH除參與調(diào)控活性氧代謝外，還與嘌呤代謝、氮代謝和激素代謝等過程相關(guān)。嘌呤代謝是氮代謝的組成部分，調(diào)控嘌呤代謝可緩解非生物脅迫的侵?jǐn)_[37]。Brychkova等[31]研究表明，擬南芥中XDH可通過調(diào)節(jié)氮代謝和活性氧代謝來緩解暗脅迫帶來的損傷。XDH與CTK[38]、ABA[39-41]及IAA[42]等植物激素的新陳代謝有關(guān)，參與應(yīng)對(duì)不良環(huán)境的調(diào)控過程。本研究從活性氧調(diào)控方面對(duì)XDH緩解水稻苗期高溫脅迫的生理機(jī)制進(jìn)行相關(guān)研究，缺乏對(duì)調(diào)控基因表達(dá)信號(hào)途徑的深入研究，這也將成為本實(shí)驗(yàn)室未來研究的主要方向。

4 結(jié)論

超表達(dá)水稻株系在高溫脅迫和恢復(fù)生長(zhǎng)后其耐高溫的生理特性明顯優(yōu)于野生型。這主要是因?yàn)榛虻某勘磉_(dá)增強(qiáng)了水稻幼苗XDH酶的活性，提高了嘌呤代謝產(chǎn)物尿囊素和尿囊酸的含量，適當(dāng)補(bǔ)償自身的抗氧化能力，同時(shí)緩解高溫脅迫對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)的損傷，降低活性氧自由基的積累，減輕對(duì)膜系統(tǒng)的損傷，提高葉片的葉綠素含量、相對(duì)含水量及可溶性蛋白含量。說明表達(dá)水平的提高能夠增強(qiáng)水稻抵御高溫脅迫的能力。

謝辭：感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所萬(wàn)建民院士實(shí)驗(yàn)室為本研究提供載體構(gòu)建及水稻遺傳轉(zhuǎn)化平臺(tái)！

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Protective Roles of Over-expression ofin Rice Seedlings Under High Temperature Stress

HAN Ruicai1, SU Ruqi1,WAN Jianlin2, LONG Qizhang2, ZENG Yongjun1, PAN Xiaohua1, SHI Qinghua1, WU Ziming1,*

(Key Laboratory of Crop Physiology,,,,,;,,,;Corresponding author,:)

【Objective】Xanthine dehydrogenase (XDH) is considered as a key enzyme in purine metabolism. This paper aims to reveal the physiological mechanism of XDH to relieve high temperature stress by analyzing the physiological indexes of rice seedling leaves differed in expression level ofunder high temperature stress. 【Method】In this work, chlorophyll content, relative water content, soluble protein content, reactive oxygen metabolism, antioxidant enzyme activities, XDH activity, allantoin and allantoate contents were measured under high temperature stress inover-expressed transgenic lines and wild type during seedling stage. 【Result】The results revealed that there were no significant difference between wild type and transgenic lines in all tested physiological parameters except XDH activity and ureides (allantoin and allantoate) content before high temperature stress. After high temperature stress for 5 days, compared with the transgenic lines, seedlings of wild type showed significantly decreased chlorophyll content, relative water content, soluble protein content, and antioxidant enzyme activities, but significantly increased contents of H2O2and Malondialdehyde(MDA). As we know that chlorophyll content, relative water content, and soluble protein content all increased in transgenic lines and wild type after post-stress recovery, especially in transgenic lines. H2O2and MDA content all decreased. For transgenic lines, these indexes were lower than those in wild type. The XDH enzyme activity and purine metabolites allantoin and allantoate contents in the wild type and transgenic lines were induced by high temperature.over-expressed transgenic lines had significantly higher XDH enzyme activity and allantoin and allantoate contents compared with wild type throughout the process. 【Conclusion】XDH can effectively improve the tolerance of rice seedlings to high temperature stress by regulating the synthesis of ureides, compensating their antioxidant capacity and enhancing the activities of antioxidant enzymes.

rice; xanthine dehydrogenase; high temperature stress; physiological mechanism

Q948.112+.2; S511.01

A

1001-7216(2018)04-0365-09

2017-10-27;

2018-03-04。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31560350,31760350)；江西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(20171ACF60018)；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2017FD0301605)。

10.16819/j.1001-7216.2018.7130