齊岳翰 李瑞莉 王芳 劉洪家,* 易可可 朱誠

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水稻溫敏轉(zhuǎn)綠突變體的鑒定和遺傳分析

齊岳翰1,2李瑞莉2,3王芳2劉洪家2,*易可可4朱誠1,*

(1中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310018;2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所/ 省部共建國家重點實驗室培育基地―浙江省植物有害生物防控重點實驗室, 杭州 310021;3浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 金華 321000;4中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所, 北京 100081;*通訊聯(lián)系人, E-mail: pzhch@ cjlu.edu.cn; lhjzju@aliyun.com)

【目的】本研究旨在鑒定和克隆水稻溫敏轉(zhuǎn)綠新基因，揭示其參與葉綠體發(fā)生發(fā)育和光合作用的分子機制，為高光效育種提供理論支撐?！痉椒ā坷幂椛湔T變的方法，從粳稻品種日本晴中篩選獲得葉片黃化突變體，并對其表型、農(nóng)藝性狀和遺傳方式進(jìn)行詳細(xì)分析。構(gòu)建了突變體與Kasalath的F2群體，利用多態(tài)性分子標(biāo)記對目的基因進(jìn)行定位和測序分析?！窘Y(jié)果】幼苗期在22℃低溫下葉片黃化，葉綠素含量僅為野生型的10%，光化學(xué)效率下降，葉綠體結(jié)構(gòu)異常；隨著溫度的升高，的葉色由黃轉(zhuǎn)綠，30℃時葉綠素含量恢復(fù)到野生型的68%，光化學(xué)效率和葉綠體發(fā)育與野生型相近。在自然環(huán)境下，突變體從苗期至成熟期均表現(xiàn)為葉片黃化，且株高、分蘗數(shù)和產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀與野生型相比差異顯著。遺傳分析表明突變體的表型由一對隱性核基因控制。將基因定位到第6染色體多態(tài)性標(biāo)記S4和S5之間84 kb的區(qū)間內(nèi)，定位區(qū)間測序發(fā)現(xiàn)突變體中編碼分子伴侶蛋白的基因(LOC_Os06g02380)發(fā)生單堿基缺失?！窘Y(jié)論】是一個新的水稻溫敏轉(zhuǎn)綠突變體，可能為突變基因。

水稻; 溫敏; 葉綠體; 基因定位

光合作用是自養(yǎng)生物將太陽能轉(zhuǎn)化為有機物的重要能量轉(zhuǎn)換過程。在高等植物中，這一過程在葉綠體中進(jìn)行，依賴于葉綠素的合成和葉綠體的發(fā)育。葉綠體作為一個半自主細(xì)胞器，它的發(fā)育受到核基因和質(zhì)體基因協(xié)同表達(dá)控制[1]。研究表明經(jīng)過長期的共生進(jìn)化，高等植物葉綠體中有2000多個蛋白，其中約100個由葉綠體基因組編碼，其余則由核基因編碼翻譯后轉(zhuǎn)入到葉綠體，大部分基因的功能及其參與葉綠體發(fā)育調(diào)控機制仍然未知[2]。植物葉色突變體是一種多發(fā)于苗期的常見突變性狀，往往由于葉綠素合成或降解途徑受阻表現(xiàn)為葉片失綠黃化或白化等葉色缺陷，從而影響植物光合作用，最終造成植物生長減弱、減產(chǎn)甚至死亡[3]。葉色突變體在研究植物光合作用機制，鑒定葉綠素生物合成與降解途徑機理，明確葉綠體結(jié)構(gòu)功能與調(diào)控機制等方面具有重要應(yīng)用價值。水稻是單子葉模式植物，全基因組測序的完成為其功能基因的研究奠定了基礎(chǔ)[4]。迄今為止，已經(jīng)報道發(fā)現(xiàn)至少180個葉色突變體，其中大部分被定位到染色體特定的區(qū)間內(nèi)，如、、、、和等多個葉色突變體[5-11]。目前已經(jīng)克隆了一些葉色相關(guān)基因，如、、、等[12-15]。

溫度是影響水稻生長發(fā)育的一個重要因素，有一類水稻葉色突變體在特定的溫度下葉片呈現(xiàn)白色、黃色或者黃綠色等葉綠素含量減少的表型，而在其他溫度下葉色幾乎正常，被稱為溫敏轉(zhuǎn)綠突變體[16]。這類突變體通常是非致死的，因而是研究葉綠體發(fā)育的理想材料[17]。目前，水稻中報道了多個溫敏轉(zhuǎn)綠突變體。例如，和突變體在20℃的低溫條件下表現(xiàn)為葉片黃化，當(dāng)生長溫度為30℃時，其葉色與野生型一樣[18]?；虻木幋a產(chǎn)物參與調(diào)控質(zhì)體RNA代謝和蛋白翻譯過程[19]?；蚓幋a的低分子量鳥苷酸激酶，在葉綠體發(fā)育早期具有特殊的重要作用[20]。和突變體在恒定溫度(20℃或30℃)下，葉片失綠；但是晝夜交替的溫度節(jié)律條件(30℃/20℃)下葉片顏色正常。和基因分別編碼核苷酸還原酶的大亞基和小亞基，參與調(diào)控DNA合成和修復(fù)所需的脫氧核苷酸的產(chǎn)生速率[21]。突變體的溫敏轉(zhuǎn)綠表型與上述和突變體相似，由一個編碼葉綠體定位蛋白的基因突變造成，但它對葉綠體的調(diào)控作用機理與前面二者可能不同[22]。()突變體和突變體在22℃溫度條件下，葉片黃化、白化，當(dāng)溫度高于28℃時，則葉色正常，基因編碼葉綠體定位的分子伴侶蛋白，能夠直接與PORA和PORB相互作用，進(jìn)而穩(wěn)定PORB蛋白[12,14,23]。編碼葉綠體伴侶蛋白OsCpn60α亞基，在葉片發(fā)育早期促進(jìn)葉綠體的發(fā)育[24]。(t)突變體對高低溫的敏感與上述相反，低于23℃溫度下生長葉色正常，葉綠素含量無變化，而在高于26℃下生長時葉片為黃綠色[25]?？梢?，溫度對葉綠素合成和葉綠體發(fā)育的影響非常復(fù)雜。

本研究利用60Co γ輻射誘變方法，獲得一個溫敏轉(zhuǎn)綠的突變體()。從表型、生理性狀、遺傳等方面對該突變體進(jìn)行了鑒定，明確了其遺傳特性，并對該突變基因進(jìn)行了精細(xì)定位和測序分析，旨在揭示參與葉綠體發(fā)育和控制光合效率的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與生長條件

本研究所用水稻突變體是由日本晴(ssp.cv. Nipponbare)種子經(jīng)60Co γ輻射誘變獲得，經(jīng)多代自交繁育，其表型和農(nóng)藝性狀已穩(wěn)定遺傳。在光照人工氣候培養(yǎng)箱(型號QHX-350BS-III)內(nèi)進(jìn)行野生型和突變體苗期的水培。培養(yǎng)溫度分別為恒定22℃、24℃、26℃、28℃和30℃，相對濕度為70％，光周期為12 h光照/12 h黑暗。培養(yǎng)溶液參照國際水稻研究所的水稻營養(yǎng)液配方。

1.2 遺傳分析和定位群體創(chuàng)建

突變體與粳稻日本晴雜交收獲F1，F(xiàn)1自花授粉收獲F2。對F1和F2進(jìn)行表型和遺傳分析。突變體與秈稻Kasalath雜交獲得的F2群體用于基因定位分析。

1.3 DNA的提取和PCR擴增

對親本以及F2遺傳群體植株采用CTAB法[26]提取DNA。PCR采用10 μL體系，模板DNA 0.5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.2 μL, dNTPs(10 μmol/L) 0.5 μL，10×PCR緩沖液 1 μL，酶0.1 μL，加ddH2O補足至10 μL。PCR擴增程序如下：94℃下預(yù)變性5 min，35個循環(huán)(94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s)；72℃下延伸7 min。PCR產(chǎn)物在3.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，EB染色，伯樂凝膠成像儀拍照。

表1 用于精細(xì)定位的多態(tài)性STS標(biāo)記

1.4 基因定位和候選基因序列測定

利用突變體與Kasalath雜交獲得的F2群體，選取22個具有突變表型植株，對近似均勻分布于12條染色體上的120對SSR分子標(biāo)記進(jìn)行初步連鎖分析。從F2群體中增選2607個突變表型單株，根據(jù)初步定位區(qū)間，同時參照粳稻(日本晴)和秈稻(9311)的序列差異(NCBI)設(shè)計新的STS(sequence-tagged site)分子標(biāo)記用于精細(xì)定位。精細(xì)定位引物序列見表1。

候選基因的序列測定，以突變體DNA為模板，利用Kod-plus高保真DNA聚合酶擴增目標(biāo)基因。PCR采用20 μL體系，模板DNA 0.5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，dNTPs(10 μmol/L) 2.0 μL，50% DMSO 2.0 μL，10×PCR緩沖液2 μL，2.5 mmol/L MgSO41.2 μL, Kod-plus酶0.4 μL，加ddH2O補足至20 μL。PCR程序如下：95℃下預(yù)變性2 min，35個循環(huán)(98℃，10 s；60℃，30 s；68℃，90 s)；68℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物送公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果與日本晴序列(NCBI)進(jìn)行比對。

1.5 光合色素含量測定

光合色素含量參照張其德法測定[27]。取光照人工氣候培養(yǎng)箱中2葉期幼苗的第1葉，稱重并剪碎后浸入10 mL 95%的乙醇中，黑暗放置約48 h，利用島津UV-1800紫外分光光度計測定萃取液在470 nm、649 nm、665 nm處的吸光值。

1.6 葉綠體超微結(jié)構(gòu)分析

透射電鏡切片分析，電鏡樣品制備參照呂典華等[28]的方法。分別取光照人工氣候培養(yǎng)箱22℃下生長14d和30℃下生長10 d的野生型和突變體葉片，用2.5 %戊二醛固定液固定4 h，然后用1% OsO4進(jìn)一步固定。固定的葉片經(jīng)過乙醇脫水，最后用環(huán)氧化樹脂包埋，樣品經(jīng)過切片、醋酸鈾染色后用Philips CM100透射電子顯微鏡觀察。

1.7 葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)測定

參照郭鵬等[29]的方法，利用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)(IMAGING-PAM, MAXⅠ)測定野生型與突變體的葉綠素?zé)晒鈩恿?shù)。在恒溫(22℃、24℃、26℃、28℃和30℃)條件下，將萌發(fā)后的野生型和突變體培養(yǎng)至2葉期。將幼苗黑暗處理30~60 min，分別測定相關(guān)光合效率系數(shù)。每次測量取野生型和突變體各5株，計算結(jié)果取平均值。

1.8 農(nóng)藝性狀分析

將光照人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3周的野生型和突變體幼苗移栽到大田中種植。成熟期分別測量野生型與突變體的株高、分蘗數(shù)、葉長、葉寬、穗長、結(jié)實率、單株有效穗數(shù)、千粒重等農(nóng)藝性狀，利用測驗分析兩者差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的表型分析

調(diào)查人工氣候培養(yǎng)箱環(huán)境下苗期和自然環(huán)境下成熟期的表型，發(fā)現(xiàn)突變體均表現(xiàn)黃化(圖1)。22℃低溫環(huán)境條件下，突變體幼苗出現(xiàn)黃化表型；30℃時苗期突變體為黃綠色表型。與野生型相比，成熟期突變體的株高降低7.0%，結(jié)實率和千粒重分別降低12.5%和11.0%，分蘗數(shù)和有效分蘗數(shù)則分別下降44.7%和52.9%。而在穗長和葉形等方面，野生型和突變體無顯著差異(表2)。

2.2 突變體對溫度的敏感及其光合色素的含量

不同溫度處理表明，突變體對溫度敏感，在22℃低溫環(huán)境下表現(xiàn)黃化，在30℃下則表現(xiàn)為黃綠(圖1)。在低溫環(huán)境下，成熟期突變體的新生葉片也表現(xiàn)黃化(圖1-C)。在5個不同環(huán)境溫度(22℃，24℃，26℃，28℃和30℃)條件下，幼苗葉片的葉綠素總含量分別為野生型的10.0%、16.8%、17.8%、24.3%和68.0%；類胡蘿卜素含量也出現(xiàn)相似的變化，突變體葉片分別為野生型的20.7%、33.4%、35.7%、43.1%和107.0%。但葉綠素a與葉綠素b的比值，野生型與突變體無顯著差異(圖2)。

表2 野生型和突變體農(nóng)藝性狀分析

**表示野生型與突變體在0.01水平上差異顯著。

**Difference between WT and mutant was significant at0.01 level.

2.3 突變體葉綠體超微結(jié)構(gòu)

對不同溫度下的野生型和突變體葉片中葉綠體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在22℃低溫環(huán)境下，野生型具有規(guī)則和多層的基粒類囊體，且基粒片層垛疊較厚，堆積緊密，而突變體葉片中基粒類囊體稀疏分散，基質(zhì)垛疊松散，出現(xiàn)更多更大的嗜鋨小體(圖3-A、B)。30℃下，突變體基粒類囊體排列整齊，基粒類囊體數(shù)目增多，嗜鋨小體的數(shù)量減少且體積縮小，葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育雖趨于完善，但未達(dá)到野生型的正常發(fā)育狀態(tài)(圖3-C、D)。

A－22℃培養(yǎng)箱生長14 d；B－30℃培養(yǎng)箱生長9 d；C－成熟期(11月)；D－成熟期(7月)。標(biāo)尺=3 cm。

Fig. 1. Phenotype of the wild type (WT) and mutant at different growth stages.

2.4 突變體的葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)

對不同溫度條件下的熒光參數(shù)測定發(fā)現(xiàn)，突變體的光系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學(xué)效率(v/m)與野生型相比差異不大；而實際光化學(xué)效率(PSⅡ)和光化學(xué)猝滅系數(shù)(P)，在22℃低溫環(huán)境下，突變體幾乎為零，隨溫度升高突變體的實際光化學(xué)效率和光化學(xué)猝滅系數(shù)逐漸增加，在28℃和30℃下，恢復(fù)到野生型水平(圖4)。

*表示野生型與突變體在0.05水平上差異顯著。

Fig. 2. Photosynthetic pigment contents in leaves of the wild type(WT) and mutant at different temperatures.

A－22℃條件下野生型；B－22℃條件下突變體；C－30℃條件下野生型；D－30℃條件下突變體。G－基粒；O－嗜鋨粒。

Fig. 3. Chloroplast ultrastructure of the wild type and mutant.

圖5 OsV15基因在第6染色體的精細(xì)定位及候選基因結(jié)構(gòu)

Fig. 5. Fine mapping ofon chromosome 6 and the structure of candidate gene.

表3 突變體后代葉色性狀的分離分析

2.5 突變體的遺傳分析

突變體與野生型日本晴正反交,后代F1在人工氣候培養(yǎng)箱和自然環(huán)境下生長都呈現(xiàn)野生型的表型，葉片顏色正常，說明該表型受隱性核基因控制。在人工氣候培養(yǎng)箱中，統(tǒng)計F2群體中正常葉色幼苗和黃葉幼苗數(shù)，綠葉幼苗有310株，黃葉幼苗有95株，分析表明，綠葉與黃葉幼苗的株數(shù)符合3∶1分離比，說明該表型受一對隱性基因控制。突變體與Kasalath雜交F2群體中，綠葉幼苗有279株，黃葉幼苗有88株，經(jīng)χ2測驗，正常株與突變株的分離比符合3: 1，也表明該表型受一對隱性基因控制(表3)。

A－最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)；B－實際光化學(xué)效率(ΦPSII)；C－光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)。

Fig. 4. Chlorophyll fluorescence kinetics parameters of the wild type(WT) and mutant at different temperatures.

2.6 OsV15基因的定位和候選基因分析

從突變體與Kasalath雜交得到的F2群體作為定位群體，首先選用近似均勻分布在水稻12條染色體上的120對SSR分子標(biāo)記定位突變基因。將突變基因初步定位到水稻第6染色體上，位于RM508和RM584分子標(biāo)記之間(圖5)。進(jìn)一步增加突變型個體數(shù)量至2607株，同時加密區(qū)間內(nèi)的標(biāo)記，最終精細(xì)定位在標(biāo)記S4和S5之間，物理距離約為84 kb(圖5)。區(qū)間內(nèi)共包含有24個開放閱讀框，測序分析發(fā)現(xiàn)突變體中，編碼分子伴侶蛋白(Cpn60β1)基因，在5154 bp處(位于最后一個外顯子上)存在堿基的缺失突變，推測其缺失導(dǎo)致編碼蛋白的移碼突變，造成突變體的表型，擬將其作為候選基因。

3 討論

水稻是世界上重要的糧食作物，葉片光合作用效率是決定水稻產(chǎn)量的重要因子之一。較高的光合作用效率依賴于葉綠素的合成和葉綠體的正常發(fā)育。因此，利用葉色突變體對葉綠體發(fā)育的調(diào)控模式、光合作用機制的研究具有重要意義。葉色突變體中包含一類溫敏轉(zhuǎn)綠型突變體，研究發(fā)現(xiàn)這類突變體在不同低溫環(huán)境下出現(xiàn)葉片黃化表型，在不同發(fā)育階段、高溫和自然環(huán)境下則呈現(xiàn)不同程度的恢復(fù)表現(xiàn)。水稻突變體和突變體在低溫環(huán)境下都出現(xiàn)葉片白化的表型，但是4葉期和5葉期后，即使低溫條件下葉片也逐漸轉(zhuǎn)綠，表明它們的溫敏轉(zhuǎn)綠同時具有發(fā)育時期特異性[22,24]。突變體幼苗在20℃時為黃葉，從第4葉期開始逐漸轉(zhuǎn)為淺黃綠色，在32℃條件下，突變體完全表現(xiàn)綠葉[30]。水稻突變體在溫度低于20℃時也具有白化的表型，但是在自然環(huán)境中從苗期到成熟期始終為黃葉的表型[31]。水稻突變體和突變體在24℃低溫環(huán)境下為明顯的突變表型，當(dāng)高于24℃時逐漸恢復(fù)野生型的表型[23,32]。本研究鑒定了一個溫敏轉(zhuǎn)綠突變體，在22℃條件下幼苗葉片黃化，當(dāng)溫度升到30℃時葉片為黃綠色。在自然環(huán)境下，突變體表現(xiàn)正常，但是遇到低溫環(huán)境時新生的葉片則表現(xiàn)為白化(圖1)，表明突變體的新生葉片中葉綠素的合成受到低溫抑制。因此，突變體是一個新的溫敏轉(zhuǎn)綠突變體。

本研究利用突變體與Kasalath雜交的F2群體，將基因精細(xì)定位到第6染色體分子標(biāo)記S4和S5之間84 kb的區(qū)間內(nèi)。對該區(qū)間的序列分析，擬將一個編碼分子伴侶蛋白OsCpn60β1的基因作為候選基因進(jìn)一步研究。植物Cpn60蛋白是由藍(lán)藻質(zhì)體GroE蛋白進(jìn)化而來,由兩類不同的亞基組成，具有輔助管家蛋白的功能。水稻基因組中有6個Cpn60亞基，3個Cpn60α亞基和3個Cpn60β亞基，之前研究發(fā)現(xiàn)水稻基因在各組織中的表達(dá)量都最高，推測它在分子伴侶蛋白功能中發(fā)揮主要作用[33]。水稻中已報道Cpn60α1和Cpn60α3蛋白都表明Cpn60蛋白對于低溫環(huán)境下葉綠體發(fā)育具有重要調(diào)控作用。在擬南芥中，突變時幼苗葉片與野生型并無差異，而和同時突變時才表現(xiàn)幼苗葉片白化[34]，表明擬南芥中不同Cpn60β亞基的功能有冗余性。本研究突變體在低溫下幼苗黃化表型，顯示水稻基因具有不同于擬南芥的重要功能和作用機制。

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Identification and Genetic Analysis of Thermo-sensitive Mutantin Rice

QI Yuehan1,2, LI Ruili2,3, WANG Fang2, LIU Hongjia2,*, YI Keke4, ZHU Cheng1,*

(1College of Life Science, China Jiliang University, Hangzhou 310018, China;2State Key Laboratory Breeding Base for Sustainable Control of Pest and Disease / Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;3College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China;4Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;*Corresponding author, E-mail: pzhch@cjlu.edu.cn;lhjzju@aliyun.com)

【Objective】The objective of the research is to identify and clone a new thermo-sensitive gene of rice, and to reveal the molecular mechanism involved in the process of chloroplast development and photosynthesis, providing theoretical support for photosynthetic efficiency breeding. 【Method】A yellow leaf mutantwas obtained from rice cultivar Nipponbare (abbreviated as Nip) mutagenized by irradiation. The phenotypic, agronomic traits and genetic patterns ofwere analyzed in detail, and F2population was constructed by crossing the mutant with Kasalath, and mutant individuals were selected to map the gene.【Result】The mutantexhibited etiolation at seedling stage, with only ten percent of the chlorophyll content of the wild type, declined photochemical efficiencyand abnormal structure of chloroplasts underlow temperature condition (22℃). Astemperature rose, leaf color of the mutantregreened due to increased chlorophyll content, which recovered to sixty-eight percent of that of the wild type under higher temperature condition (30℃). In natural environment,showed leaf yellowing from seedling stage to maturity stage, and significant differences in plant height, tiller number, seed setting rate and so on. Genetic analysis revealed that the mutant phenotype ofwas controlled by a single recessive gene. The gene was located in the 84 kb region of chromosome 6, between molecular markers S4 and S5. Sequencing analysisin this region showed that(LOC_Os06g02380) that encodes a putative chaperonin 60 beta precursor, carried a single base deletion in.【Conclusion】is a new thermo-sensitive mutant, andmay be the mutant gene.

rice; thermo-sensitive; chloroplast;gene mapping

Q343.5; S511.032

A

1001-7216(2018)04-0349-08

2017-11-01；

2018-02-06。

國家自然科學(xué)基金資助項目(31571633)；浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LY17C150008)。

10.16819/j.1001-7216.2018.7131