袁平平 孫楓 倪海平 朱佳慧 周益軍 蔣選利 徐秋芳,*

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水稻黑條矮縮病毒基因?qū)λ镜倪z傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析

袁平平1, 2孫楓2倪海平2朱佳慧2周益軍2蔣選利1,*徐秋芳2,*

(1貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 貴陽(yáng) 550025;2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所, 南京 210014；*通訊聯(lián)系人, E-mail: xuqiufang@jaas.ac.cn; JXL3237@163.com)

【目的】通過(guò)在水稻中過(guò)量表達(dá)水稻黑條矮縮病毒(, RBSDV)基因，分析RBSDV是否是導(dǎo)致水稻不育的重要致病因子，并明確過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)病毒的抗性?！痉椒ā坎捎肦T-PCR方法從感病植物中擴(kuò)增獲得RBSDV基因，構(gòu)建pCAMBIA-1300-P7-1載體，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因水稻，觀察水稻是否能夠正常結(jié)實(shí)，并采用人工接種病毒方法分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性。【結(jié)果】過(guò)量表達(dá)RBSDV的轉(zhuǎn)基因水稻生長(zhǎng)、結(jié)實(shí)正常。在接種7 d和14 d時(shí)轉(zhuǎn)基因植株中病毒積累量顯著低于野生型對(duì)照，但在28 d時(shí)部分轉(zhuǎn)基因株系中病毒積累量高于對(duì)照，接種30 d時(shí)轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)病率與對(duì)照無(wú)明顯差異?！窘Y(jié)論】在水稻中過(guò)量表達(dá)RBSDV不影響水稻的結(jié)實(shí)；轉(zhuǎn)基因水稻在RBSDV侵染早期可抑制病毒的積累，但在后期對(duì)病毒的抗性與對(duì)照沒(méi)有明顯差異。

水稻黑條矮縮病毒；過(guò)量表達(dá)；育性；抗性評(píng)價(jià)

水稻黑條矮縮病毒(, RBSDV)為呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬()成員，主要通過(guò)介體灰飛虱以持久增殖方式傳播，可侵染水稻、小麥、玉米等禾本科植物[1]。水稻感染該病毒后表現(xiàn)為植株矮縮，葉色濃綠，不抽穗或穗小，葉脈和莖稈上早期出現(xiàn)蠟白色、后期出現(xiàn)黑褐色的瘤狀突起[2]。20世紀(jì)60年代和90年代后期，水稻黑條矮縮病在我國(guó)暴發(fā)流行，部分地區(qū)病害發(fā)生率超過(guò)了90%[3]。2007年以來(lái)，該病害又在江蘇等地粳稻上普遍發(fā)生，2008年僅江蘇省發(fā)病面積達(dá)26.7萬(wàn)hm2，2009年增加到33.3萬(wàn) hm2，且由于目前生產(chǎn)上推廣的品種絕大多數(shù)不抗水稻黑條矮縮病，對(duì)水稻生產(chǎn)造成巨大威脅[4]。

RBSDV病毒基因組由10條線性雙鏈RNA組成，根據(jù)其在聚丙烯酰胺凝膠上的遷移速率由快到慢的順序依次稱(chēng)為S1~S10。S7全長(zhǎng)2193 nt，編碼363個(gè)氨基酸，含有兩個(gè)不重疊的ORF，編碼兩個(gè)蛋白P7-1和P7-2，均為病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白[5]。在感病植物和介體昆蟲(chóng)中均可檢測(cè)到P7-1蛋白的表達(dá)，但在不同寄主中的大小存在差異。在感病植物中P7-1蛋白的大小為41 kD，而在昆蟲(chóng)中則為44 kD，暗示P7-1在不同的寄主中可能存在不同的修飾[6]。免疫膠體金標(biāo)記顯示P7-1在管狀結(jié)構(gòu)中大量存在，表明其為管狀結(jié)構(gòu)的主要組成部分，在RBSDV侵染的細(xì)胞中，管狀結(jié)構(gòu)常常不完全封閉，其中含有大量病毒顆粒[6]。P7-1的亞細(xì)胞定位分析表明，該蛋白在質(zhì)壁分離的細(xì)胞中可定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周?chē)?，并與胞間連絲的標(biāo)記蛋白PDLP1存在共定位[7]。

植物感染RBSDV后表現(xiàn)矮化，不能正常抽穗結(jié)實(shí)。在非寄主植物擬南芥中過(guò)量表達(dá)RBSDV基因后花藥不能開(kāi)裂，花藥中的木質(zhì)素含量顯著下降，轉(zhuǎn)基因植株不能正常結(jié)實(shí)[8]。由于擬南芥不是RBSDV的寄主植物，為進(jìn)一步研究RBSDV基因功能，明確其是否是導(dǎo)致寄主植物不育的致病因子，我們構(gòu)建了pCAMBIA1300-P7-1的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化水稻日本晴，獲得了過(guò)量表達(dá)RBSDV P的轉(zhuǎn)基因植株，并分析了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)病毒的抗性。

1 材料與方法

1.1 材料

用于擴(kuò)增水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)基因的感病水稻采自江蘇省泰州市姜堰區(qū)，用于接種的灰飛虱由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所病害室飼養(yǎng)保存。用于遺傳轉(zhuǎn)化的水稻品種為日本晴。

1.2 RBSDV P7-1基因的克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中RBSDV基因(登錄號(hào)：AF397894)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因的PCR引物-I-F和-I-R(表1)，擴(kuò)增產(chǎn)物的理論大小為1089 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

采用Trizol試劑(TaKaRa)提取感染RBSDV的水稻葉片總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser, TaKaRa)合成cDNA。PCR體系如下：cDNA 1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，10×緩沖液2.5 μL，dNTP 0.5 μL，酶0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。PCR條件如下：94℃下5 min；94℃下1 min，56℃下40 s，72℃下1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃下延伸10 min。

的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA回收后連接至pMD18-T載體，采用菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆后，提取質(zhì)粒，酶切鑒定插入片段大小。酶切正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核酸序列比對(duì)，采用DNASTAR軟件分析氨基酸序列的同源性，獲取pMD18T-P7-1重組質(zhì)粒。

表1 本研究所用引物

1.3 重組表達(dá)載體pCAMBIA-1300-P7-1的構(gòu)建

用限制性?xún)?nèi)切酶I和I酶切pMD18T- P7-1重組質(zhì)粒，酶切所得基因片段回收后用T4連接酶定向連接至pCAMBIA-1300表達(dá)載體。采用擴(kuò)增基因引物進(jìn)行PCR，篩選陽(yáng)性克隆，采用I和I酶切陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，獲得pCAMBIA-1300-P7-1重組表達(dá)載體。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)

1.4.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

挑選成熟、飽滿(mǎn)的水稻種子，去穎殼后進(jìn)行水稻愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)，將pCAMBIA- 1300-P7-1質(zhì)粒采用電擊法導(dǎo)入GV3101農(nóng)桿菌，挑選愈傷組織后進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，在篩選培養(yǎng)基上篩選后，進(jìn)行分化、生根培養(yǎng)，獲得T0轉(zhuǎn)基因植株。

1.4.2 轉(zhuǎn)基因水稻鑒定

采用CTAB法提取T0代轉(zhuǎn)基因植株葉片總DNA。用擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶()基因的引物-F和-R進(jìn)行PCR檢測(cè)。采用Trizol法提取轉(zhuǎn)基因植株葉片總RNA后，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用-F/-R(表1)和-I-F/-I-R引物分別檢測(cè)和基因的表達(dá)。

T0陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株收種后，采用CTAB法提取T1轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA，采用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，收取分離比接近3∶1的T1轉(zhuǎn)基因植株的種子，檢測(cè)對(duì)應(yīng)T2株系分離情況，T2株系不發(fā)生分離的認(rèn)為是純合轉(zhuǎn)基因株系。

1.5 RBSDV P7-1基因表達(dá)分析

提取培養(yǎng)20 d的T2代轉(zhuǎn)基因植株葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用擴(kuò)增的引物(-I-F/-I-R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析轉(zhuǎn)基因植株中基因是否表達(dá)。此外，采用熒光定量PCR(qRT-PCR)分析基因的相對(duì)表達(dá)量。基因的擴(kuò)增引物為-F1和-R1，的擴(kuò)增引物為-F和-R(表1)。qRT-PCR參照Xu等[10]的方法進(jìn)行。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株對(duì)RBSDV的抗性分析

挑選4個(gè)T2代純合轉(zhuǎn)基因株系(#-14，#-19，#-40，#-46)，采用人工接種方法接種RBSDV，以野生型日本晴作為對(duì)照。人工接種RBSDV參照周彤等[9]的方法進(jìn)行，略有修改。將1~2齡無(wú)毒灰飛虱若蟲(chóng)在感染RBSDV的水稻病株上飼喂7 d后，轉(zhuǎn)接至武育粳3號(hào)水稻幼苗上，飼養(yǎng)7 d使其度過(guò)循回期，采用ELISA方法檢測(cè)灰飛虱的帶毒率，將攜帶RBSDV的灰飛虱按2或3頭/株的蟲(chóng)量接種于3葉期野生型日本晴和T2代轉(zhuǎn)基因水稻上，每株苗接種3頭有效蟲(chóng)；同時(shí)接種不攜帶RBSDV的無(wú)毒灰飛虱作為對(duì)照。接種2~3 d后將水稻苗移栽至大田，接種30 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。

人工接種RBSDV 7 d、14 d、21 d、28 d時(shí)，將每個(gè)品系的水稻葉片進(jìn)行混合取樣，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用qRT-PCR分析轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株中編碼病毒外殼蛋白的基因表達(dá)情況，以水稻為內(nèi)參基因。RBSDV引物為RBSDV-F和RBSDV-R。qRT-PCR參照Xu等[10]的方法進(jìn)行。

A－PCR擴(kuò)增RBSDV P7-1基因(M－DNA標(biāo)記，泳道1和2分別為以健康和感病植株cDNA擴(kuò)增P7-1的PCR產(chǎn)物)；B－PCR篩選pMD18T-P7-1陽(yáng)性克隆；C和D－pMD18-T-P7-1和pCAMBIA-1300-P7-1質(zhì)粒的酶切分析(泳道5和7為重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，泳道6和8為未酶切的質(zhì)粒對(duì)照)。

Fig. 1. Construction of the pCAMBIA-1300-P7-1 expression vector.

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻黑條矮縮病毒P7-1基因克隆及序列分析

以感染RBSDV的水稻cDNA為模板，采用-I-F/-IR為引物，PCR擴(kuò)增基因。瓊脂糖凝膠電泳分析表明，PCR擴(kuò)增獲得一條約1.1kb的條帶，與目的基因理論大小1089 bp相符(圖1-A)。PCR產(chǎn)物回收后連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后采用PCR篩選獲得陽(yáng)性克隆(圖1-B)。陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用I和I進(jìn)行雙酶切，可獲得一條與目的基因大小一致的條帶(圖1-C)，表明基因已連入pMD18-T載體。pMD18T-P7-1測(cè)序結(jié)果表明，克隆所得基因ORF長(zhǎng)為1089 bp，編碼363個(gè)氨基酸。在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)測(cè)序所得序列與RBSDVCDS核酸序列(登錄號(hào)：AF397894)有2個(gè)堿基的差異，同源性為99.8%，蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)有1個(gè)位點(diǎn)的差異，同源性為99.7%，表明擴(kuò)增所得基因?yàn)镽BSDV基因。

2.2 重組表達(dá)載體pCAMBIA-1300-P7-1的構(gòu)建

采用限制性?xún)?nèi)切酶I和I酶切pMD18T-P7-1質(zhì)粒，獲得基因片段，回收后定向連接至經(jīng)相同酶酶切的pCAMBIA-1300植物雙元表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)載體pCAMBIA- 1300-P7-1。重組載體用I/I進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示pCAMBIA-1300-P7-1雙酶切后可獲得與理論大小一致的條帶(圖1-D)，表明成功構(gòu)建獲得重組表達(dá)載體pCAMBIA-1300-P7-1。

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和分子檢測(cè)

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pCAMBIA-1300-P7-1轉(zhuǎn)化至水稻日本晴。經(jīng)愈傷誘導(dǎo)、共培養(yǎng)、篩選、分化和生根等步驟，在含有潮霉素的培養(yǎng)基上篩選獲得52株具有抗性的T0代轉(zhuǎn)基因植株。為明確所得T0轉(zhuǎn)基因植株是否為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，提取T0轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA后，PCR擴(kuò)增基因，結(jié)果顯示PCR可擴(kuò)增獲得大小約1 kb的條帶(圖2)，與目的片段大小(1009 bp)一致，表明所檢測(cè)T0植株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

提取T0轉(zhuǎn)基因植株葉片總RNA后，進(jìn)行RT-PCR，分析和RBSDV基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，T0轉(zhuǎn)基因植株中可擴(kuò)增獲得與和基因大小相符的條帶(圖3)，表明RBSDV基因在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)。

2.4 轉(zhuǎn)基因水稻中RBSDV P7-1基因的表達(dá)分析

為明確T2轉(zhuǎn)基因植株中基因的表達(dá)情況，采用RT-PCR和qRT-PCR分析了4個(gè)T2純合轉(zhuǎn)基因株系(#-14，#-19，#-40，#-46)中的表達(dá)情況。PCR結(jié)果表明，在4個(gè)株系中均有表達(dá)(圖4)。qRT-PCR結(jié)果分析顯示，在4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中RBSDV的相對(duì)表達(dá)量分別為基因的0.32、26.3、38.17和17.55倍(圖5)。

M－DNA標(biāo)記；1~52：轉(zhuǎn)基因植株。

M, DNA marker, Lanes 1 to 52, Transgenic rice lines.

圖2 T0轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

Fig. 2. PCR identification of T0transgenic plants.

A－RBSDV P7-1基因擴(kuò)增; B－HPT基因擴(kuò)增。M－DNA標(biāo)記；1~52：轉(zhuǎn)基因植株。

Fig. 3. Expression analysis ofandgene in T0transgenic plants by RT-PCR.

M, DNA標(biāo)記; #-14, #-19, #-40和#-46, T2轉(zhuǎn)基因株系。下同。

Fig. 4. Detection ofgenes in T2plants by RT-PCR.

柱上標(biāo)不同小寫(xiě)字母代表差異達(dá)0.05顯著水平。

Fig. 5. Expression ofgene in T2transgenic plants by qRT-PCR.

2.5 轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)RBSDV的抗性分析

RBSDV轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)狀態(tài)和結(jié)實(shí)情況與對(duì)照相似，均可正常結(jié)實(shí)(圖6)，表明基因過(guò)量表達(dá)不影響水稻的結(jié)實(shí)。為分析過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)RBSDV是否具有抗性，轉(zhuǎn)基因植株接種RBSDV后，采用qRT-PCR分析了過(guò)量表達(dá)對(duì)病毒積累量的影響。在接種病毒7 d和14 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株中病毒的積累量顯著低于野生型對(duì)照，接種7 d時(shí)，#-14、#-19、#-40和#-46中基因的表達(dá)量分別為對(duì)照的11.5%、5.7%、6.2%和21.3%。在接種21 d時(shí)，4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中有2個(gè)株系的病毒積累量低于對(duì)照，但至接種28 d時(shí)，#-19和#-46轉(zhuǎn)基因植株中病毒的積累量與對(duì)照無(wú)顯著性差異，#-14和#-40植株中病毒積累量甚至顯著高于對(duì)照(圖7)。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株僅在病毒侵染早期對(duì)病毒具有一定的抗性。

RBSDV接種轉(zhuǎn)基因植株30 d后，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。每株接種3頭帶毒蟲(chóng)，4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照的發(fā)病率分別為81.1%、86.7%、84.6%、80.0%和87.5%。每株接種2頭帶毒蟲(chóng)，4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照的發(fā)病率分別為70.6%、75.0%、92.0%、72.2%和80.0%，表明過(guò)量表達(dá)基因后轉(zhuǎn)基因植株對(duì)RBSDV不具有抗性。

3 討論

由RBSDV侵染引起的水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病自20世紀(jì)60年代發(fā)生流行至今，已有50多年的歷史。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，在RBSDV病毒基因功能、病毒與植物互作及病毒致病機(jī)制等方面均取得了較大進(jìn)展[10-13]。RBSDV侵染寄主植物后的轉(zhuǎn)錄組和miRNA測(cè)序、蛋白質(zhì)組分析等結(jié)果表明細(xì)胞壁合成相關(guān)基因、激素途徑等可能調(diào)控了植株矮縮、不育等癥狀[14-15]，但病毒侵染導(dǎo)致植物矮縮并影響結(jié)實(shí)的機(jī)制還有待深入研究。已有研究表明RBSDV P7-1蛋白在擬南芥中過(guò)量表達(dá)后，花藥不能開(kāi)裂進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株不能結(jié)實(shí)，P7-1很有可能是病毒侵染后導(dǎo)致植株不育的重要因子[8]。為分析P7-1蛋白在病毒致病過(guò)程中的作用，我們?cè)谒局羞^(guò)量表達(dá)了基因，然而，轉(zhuǎn)基因水稻并未表現(xiàn)不能結(jié)實(shí)的癥狀，其后代植株也能正常結(jié)實(shí)(圖6)。因此，P7-1是否是病毒侵染后導(dǎo)致植物不育的致病因子還需進(jìn)一步研究。

通過(guò)表達(dá)病毒基因獲得抗病轉(zhuǎn)基因植物是抗病毒基因工程的主要策略之一。自1986年在煙草中過(guò)量表達(dá)煙草花葉病毒(TMV)外殼蛋白基因獲得能穩(wěn)定遺傳的抗病毒轉(zhuǎn)基因煙草以來(lái)[16]，利用病毒蛋白基因如外殼蛋白、病毒復(fù)制酶基因和運(yùn)動(dòng)蛋白等介導(dǎo)植物對(duì)病毒產(chǎn)生抗性有許多成功例子[17-18]。為明確本研究獲得的過(guò)量表達(dá)RBSDV轉(zhuǎn)基因植株是否具有對(duì)病毒的抗性，我們采用人工接種RBSDV的方法分析了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)病毒的抗性。結(jié)果顯示，接種病毒7 d和14 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株中病毒積累量顯著低于對(duì)照，但至接種28 d時(shí)轉(zhuǎn)基因植株中的病毒積累量沒(méi)有下降，且接種30 d時(shí)轉(zhuǎn)基因植株發(fā)病率與對(duì)照沒(méi)有顯著差異，表明過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株不具有對(duì)RBSDV抗性。有研究報(bào)道，在水稻中過(guò)量表達(dá)水稻矮縮病毒(RDV)的非結(jié)構(gòu)蛋白Pns11的轉(zhuǎn)基因植株不表現(xiàn)對(duì)RDV的抗性[19]。這表明在植物中表達(dá)病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因不一定能產(chǎn)生對(duì)病毒的抗性。

病毒運(yùn)動(dòng)蛋白基因可介導(dǎo)植物對(duì)病毒抗性。將番茄斑駁病毒(TMoV)或煙草花葉病毒(TMV)缺失突變后的運(yùn)動(dòng)蛋白導(dǎo)入煙草后，轉(zhuǎn)基因煙草可以抑制TMoV或TMV病毒侵染[20-22]。將菜豆矮化花葉病毒(BDMV)野生型或突變的運(yùn)動(dòng)蛋白BV1或BC1基因?qū)氲椒押筠D(zhuǎn)基因番茄能推遲ToMV的感染[23]。RBSDV P7-1可在細(xì)胞內(nèi)形成管狀結(jié)構(gòu)[7,24]，在植物中P7-1可定位于胞間連絲處[7]。轉(zhuǎn)基因植株在接種病毒7 d和14 d時(shí)，病毒積累量顯著低于對(duì)照，推測(cè)過(guò)量表達(dá)后在胞間連絲處通過(guò)影響病毒細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)減緩病毒侵染。

WT, 野生型; #-14, #-19, #-40和#-46, T2轉(zhuǎn)基因株系。下同。

Fig. 6. Seed setting of the T2transgenic plants with overexpression of RBSDV.

*代表與野生型相比差異達(dá)0.05顯著水平。

Fig. 7. Relative expression of RBSDVin transgenic plants as infected by virus for various time.

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Genetic Transformation ofGene in Rice and Its Virus Resistance Analysis

YUAN Pingping1, 2, SUN Feng2, NI Haiping2, ZHU Jiahui2, ZHOU Yijun2, JIANG Xuanli1,*, XU Qiufang2,*

(1College of Agriculture, Guizhou University, Guiyang 550025, China;2Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;*Corresponding author, E-mail: xuqiufang@jaas.ac.cn; JXL3237@163.com)

【Objective】The purpose of this study is to determine whether(RBSDV)is an important pathogenic factor related to infertility in rice and to analyze the resistance of thetransgenic rice to RBSDV by overexpression ofin rice. 【Method】RBSDVgene was amplified from virus-infected plants by RT-PCR. The recombination plasmid pCAMBIA-1300-P7-1 was constructed and transformed to rice bytransformation. The fertility of transgenic plants was evaluated and the resistance of the transgenic rice plants to RBSDV was identified by artificial inoculation of virus. 【Result】The transgenic plants showed normal growth and fertility. The virus accumulation in the transgenic plants was significantly lower than the wild type at 7 days and 14 days after inoculation, but it was higher in some transgenic lines than the control at 28 days after inoculation. There were no significant differences in disease incidence between the transgenic plants and the wild type at 30 days after inoculation. 【Conclusion】 Overexpressing RBSDVin rice does not affect the fertility. Transgenic rice had lower accumulation of virus in the early stage after RBSDV infection, but did not exhibit resistance to the virus at the later stage.

; overexpression; fertility; resistance evaluation

S435.111.4+9; S511.034

A

1001-7216(2018)04-0342-07

2018-01-05;

2018-05-08。

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2016YFD0300706)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31471768)。

10.16819/j.1001-7216.2018.8014