(開封市婦幼保健院，河南 開封 475002)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)指妊娠期間發(fā)生或者首次發(fā)生的不同程度的葡萄糖不耐受，但不排除妊娠前存在糖代謝異常的可能[1,2]。妊娠期糖尿病導(dǎo)致胎兒呼吸窘迫綜合征癥和巨大胎兒等并發(fā)癥增加，其治療先以運(yùn)動飲食為主，如控制嚴(yán)重不佳再給予胰島素干預(yù)。MTNR1A等不同基因多態(tài)性與GDM發(fā)病相關(guān)[3]。該病發(fā)病機(jī)理未闡明，DNA和RNA編輯修復(fù)功能基因多態(tài)性與其有一定相關(guān)性。本研究旨在通過檢測妊娠期糖尿病和正常產(chǎn)婦胎盤中ADAR2的表達(dá)情況，并分析運(yùn)動飲食治療和胰島素治療的胎盤表達(dá)ADAR2是否有明顯差異，報告如下。

1 資料與方法

1.1 免疫組化

收集妊娠糖尿病產(chǎn)婦的胎盤組織，按照傳統(tǒng)方式進(jìn)行組織石蠟切片制作，脫蠟后復(fù)染色。ADAR2表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為判定陽性細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)選取5個400倍視野觀察記錄。評分標(biāo)準(zhǔn)0為陰性，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.2 光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

通過倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并照相。收集培養(yǎng)的細(xì)胞用4℃預(yù)冷的2%戊二醛固定2 h，再用0.1M二甲砷酸鈉緩沖液換液三次，每次2 h。之后用1%鋨酸4℃固定2 h，用0.1M二甲砷酸鈉緩沖液換液二次，每次15 min。接著梯度酒精脫水，環(huán)氧丙烷滲透，包埋，制備超薄切片，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.3 Western bolt

利用RIPA Buffer 裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，取20μL各組已處理的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳并在恒流200 mA，冰水浴條件下電轉(zhuǎn)60 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉液完全封閉1 h，以封閉液按1∶1 000稀釋乙抗體，將上述PVDF膜浸泡其中孵育3 h后，用TBST溶液洗膜，然后與1∶8 000稀釋的二抗孵育1 h后利用ECL試劑盒化學(xué)發(fā)光顯色。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR 法檢測

Trizol法提取SKOV-3和SKOV-3-Taxol細(xì)胞總RNA， RT-PCR 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 2-△△CT法計算mRNA的相對表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參. 每個實(shí)驗組重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同組間實(shí)驗數(shù)據(jù)的比較均采用單因素方差分析，兩組間的比較采用 LSD-t 檢驗，檢驗水準(zhǔn) α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測妊娠糖尿病產(chǎn)婦胎盤的ADAR2表達(dá)

妊娠期糖尿病(A組)和妊娠期非糖尿病(B組)中ADAR2陽性表達(dá)率分別為92.7%(38/41)和84.6%(33/39)。如圖1AB分別表示A組的低倍鏡(x100)和高倍鏡(x400)表達(dá)均高于B組(圖C、D)。其中，A組中ADAR2陰性3例，弱陽性5例，陽性17例和強(qiáng)陽性19例；B組中ADAR2陰性6例，弱陽性18例，陽性11例和強(qiáng)陽性6例。

2.2 電鏡下檢測妊娠糖尿病產(chǎn)婦胎盤的ADAR2表達(dá)

透射電鏡下觀察滋養(yǎng)層細(xì)胞和細(xì)胞中，妊娠期糖尿病組的胎盤中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組中ADAR2定位于細(xì)胞膜、微絨毛和部分細(xì)胞漿內(nèi)(圖2A，x10 000)。微絨毛內(nèi)ADAR2表達(dá)強(qiáng)陽性(圖2B，x15 000)。運(yùn)動和飲食治療妊娠期糖尿病組的胎盤中，ADAR2主要定位于微絨毛、細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中，弱陽性表達(dá)(圖2C，x12 000)。微絨毛內(nèi)ADAR2表達(dá)弱陽性(圖2D，x25 000)。胰島素治療妊娠期糖尿病組的胎盤中，ADAR2主要定位于微絨毛、細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中，弱陽性表達(dá)(圖2E，x8 000)。微絨毛內(nèi)ADAR2表達(dá)弱陽性(圖2F，x15 000)。

圖1 妊娠糖尿病和正常產(chǎn)婦胎盤中ADAR2的表達(dá)

圖2 電鏡下妊娠糖尿病和正常產(chǎn)婦胎盤中ADAR2的表達(dá)

2.3 Western Blot和PCR檢測妊娠糖尿病產(chǎn)婦胎盤的ADAR2表達(dá)

與B組相比，A組胎盤中ADAR2 mRNA相對水平明顯上升(2.47±0.15對比1.83±0.13,P<0.05)，其中運(yùn)動飲食治療C組和胰島素治療D組的ADAR2 mRNA相對水平明顯低于A組，分別為(1.89±0.13)和(1.73±0.04)。見圖3a和3b。

2.4 Western Blot檢測產(chǎn)婦胎盤的ADAR2蛋白表達(dá)

Western Blot檢測ADAR2 蛋白表達(dá)結(jié)果顯示與B組相比，A組胎盤中ADAR2 蛋白明顯上升(2.51±0.15對比1.81±0.10,P<0.05)，其中運(yùn)動飲食治療C組和胰島素治療D組的ADAR2 mRNA明顯低于A組，分別為(1.82±0.05)和(1.79±0.05)。見圖3c和3d。

圖3 妊娠糖尿病和正常產(chǎn)婦胎盤中ADAR2的mRNA和蛋白表達(dá)

3 討論

妊娠期糖尿病是困擾妊娠婦女的常見問題，導(dǎo)致胎兒呼吸窘迫綜合征和巨大胎兒等并發(fā)癥發(fā)生率明顯增加。不同基因多態(tài)性與GDM發(fā)病相關(guān)，主要相關(guān)基因包括MTNR1B、TCF7L2和IRS1等，基因多態(tài)性發(fā)生率顯著高于妊娠期非糖尿病產(chǎn)婦，且亞洲人群的TCF7L2和PPARG基因多態(tài)性與妊娠期糖尿病存在一定相關(guān)性，但在高加索人群未發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果[4，5]。

RNA編輯是轉(zhuǎn)錄后mRNA和tRNA堿基變化現(xiàn)象，RNA編輯酶ADAR2是ADAR家族中關(guān)鍵酶，編輯底物主要是谷氨酸受體等[3]。本研究結(jié)果顯示ADAR2在妊娠期糖尿病A組胎盤表達(dá)陽性率較高。與妊娠期非糖尿病B組相比，妊娠期糖尿病A組胎盤中ADAR2 mRNA明顯上升，其中運(yùn)動飲食治療C組和胰島素治療D組的ADAR2 mRNA明顯低于妊娠期糖尿病組。關(guān)于ADAR2基因調(diào)控葡萄糖代謝的研究較少，其血糖調(diào)控機(jī)制失調(diào)可能是胰島細(xì)胞和胎盤細(xì)胞中ADAR2表達(dá)上升造成，與JNK磷酸化水平上升相關(guān)。在本研究中，后續(xù)檢測ADAR2蛋白表達(dá)，其變化與mRNA變化結(jié)果相似，進(jìn)一步證實(shí)胎盤ADAR2的表達(dá)失調(diào)與血糖調(diào)節(jié)失調(diào)相關(guān)。通過運(yùn)動飲食治療組和胰島素治療，均能改善患者的血糖失調(diào)嚴(yán)重程度，可能與降低ADAR2表達(dá)存在顯著關(guān)系。目前胰島素與ADAR2表達(dá)相關(guān)報道不多。Yang等證實(shí)ADAR2在胰腺細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)糖代謝，且與神經(jīng)遞質(zhì)受體和離子通道功能相關(guān)。在基因沉默ADAR2的胰腺細(xì)胞中結(jié)果顯示ADAR2的基因沉默顯著影響葡萄糖刺激的胰島素分泌，并且顯著降低氯化鉀刺激的胰島素分泌[5]。ADAR2定位于胰島內(nèi)分泌細(xì)胞，在胰島素抵抗的小鼠胰腺組織中可見長期喂養(yǎng)高脂肪飲食的ADAR2表達(dá)翻倍，同時高脂肪飲食可誘導(dǎo)代謝應(yīng)激，在胰島細(xì)胞中明顯增強(qiáng)RNA的轉(zhuǎn)錄編碼離子型谷氨酸受體亞單位。此外，在空腹能量不足時，ADAR2蛋白表達(dá)受到抑制，但在給小鼠喂養(yǎng)后可完全可逆轉(zhuǎn)ADAR2的低表達(dá)情況。

ADAR2與II型糖尿病基因多態(tài)性存在一定相關(guān)性，主要表現(xiàn)在亞洲印度人群中。且ADAR2可以結(jié)合dsRNA通過堿基堿基相互作用編輯RNA，其底物主要是以谷氨酸受體為主，與GluA2相關(guān)，介導(dǎo)疼痛中ADAR2表達(dá)及作用。

總之，ADAR2表達(dá)在妊娠期糖尿病產(chǎn)婦的胎盤中高表達(dá)，運(yùn)動飲食干預(yù)和胰島素治療可下調(diào)其ADAR2表達(dá)水平，提示ADAR2可能是妊娠期糖尿病治療的潛在靶點(diǎn)，為臨床上妊娠期糖尿病飲食指導(dǎo)和胰島素治療提供理論依據(jù)。