卓啟苗，丁彥芬，余 慧，朱貴珍

(南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，南京 210000)

歐洲衛(wèi)矛(Euonymuseuropaea)是衛(wèi)矛科(Celastraceae)衛(wèi)矛屬(Euonymus)植物，落葉灌木或小喬木，原產(chǎn)歐洲及西亞地區(qū)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的園藝栽培與育種，歐洲衛(wèi)矛現(xiàn)如今已擁有豐富的園藝品種，是歐洲及北美地區(qū)著名的秋季觀果及色葉俱佳的植物。歐洲衛(wèi)矛秋色葉觀賞期從9月份開(kāi)始直到11月份，紅葉滿枝，極具觀賞特色和應(yīng)用價(jià)值。在園林配置時(shí)，可點(diǎn)綴于林緣，或與其他小灌木叢植。目前，歐洲衛(wèi)矛在中國(guó)華東、華北地區(qū)均有引種，值得進(jìn)一步推廣種植。

通常，秋色葉植物秋季葉色變紅是由于葉片中花色素苷大量合成，使得葉片中的色素種類和比例發(fā)生了變化[1]。研究認(rèn)為，可溶性糖與花色素苷含量呈顯著性正相關(guān)[2]，同時(shí)花色素苷合成相關(guān)酶PAL(苯丙氨酸解氨酶)[3]以及降解相關(guān)酶POD(過(guò)氧化物酶)、PPO(過(guò)氧化物酶)[4]均影響著花色素苷的合成積累。前人對(duì)歐洲衛(wèi)矛的研究主要集中于生態(tài)習(xí)性[5]、藥用價(jià)值[6-7]、引種繁殖[8-9]、光合特性[10]等方面，尚未有關(guān)于歐洲衛(wèi)矛葉片秋季變色機(jī)理方面的報(bào)道。因此，本研究將以歐洲衛(wèi)矛的3個(gè)品種‘矮生’(Euonymuseuropaea‘Pumilis’)、‘八仙花’(E.europaea‘Aldenhamensis’)和‘白果’(E.europaea‘Albus’)為試驗(yàn)材料，測(cè)定9月中旬至11月中旬轉(zhuǎn)色期內(nèi)葉色參數(shù)、葉綠素、類胡蘿素、花色素苷、可溶性糖含量及PAL、POD、PPO等酶活性的變化，分析各種色素與葉色參數(shù)、可溶性糖、相關(guān)酶的關(guān)系，對(duì)歐洲衛(wèi)矛在秋冬轉(zhuǎn)色期間葉色變化的生理特性進(jìn)行初步探討，為歐洲衛(wèi)矛呈色機(jī)理的理論研究提供定量數(shù)據(jù)分析和理論指導(dǎo)，最終為歐洲衛(wèi)矛的園林應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地點(diǎn)位于江蘇句容市乾景天園苗木有限公司基地，以歐洲衛(wèi)矛3個(gè)品種‘矮生’(Euonymuseuropaea‘Pumilis’)、‘八仙花’(E.europaea‘Aldenhamensis’)和‘白果’(E.europaea‘Albus’)為試材，各品種均為3年生扦插苗，株高2.5 m，各品種長(zhǎng)勢(shì)一致，無(wú)病蟲(chóng)害。

1.2 試驗(yàn)方法

每個(gè)品種選取15株作為樣品，每5株為1次重復(fù)，共3個(gè)重復(fù)。各材料于2017年9月下旬至11月下旬，每隔10 d取樣1次。取樣于每天上午10：00前后進(jìn)行，每次取樹(shù)冠中部向陽(yáng)面相同葉位的葉片。

葉片取回后，立即洗凈，擦干，去掉主脈后剪碎，混勻，用于葉綠素、花色素苷、可溶性糖含量及酶活性的測(cè)定，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。葉色參數(shù)的測(cè)定參照郭歡歡等[11]的方法；葉綠素和類胡蘿素含量測(cè)定采用丙酮浸提法[12]；花色素苷含量測(cè)定采用鹽酸甲醇浸提法[13]；可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法[12]；苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定參照Lister等[14]和李合生[15]的方法；多酚氧化酶(PPO)活性測(cè)定參照李明等[16]、楊暖[17]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐洲衛(wèi)矛葉色參數(shù)變化特征

葉色參數(shù)是利用色差計(jì)來(lái)定量表征色澤在三維空間中變化的變量值。L*用來(lái)表示光澤明亮度，其值越大明亮度越高。a*值是紅/綠的比值，正值表示偏紅，負(fù)值表示偏綠。b*值是黃/藍(lán)程度，b*值越大，呈現(xiàn)黃色越深；反之，藍(lán)色越深。歐洲衛(wèi)矛在整個(gè)轉(zhuǎn)色期過(guò)程中，品種‘八仙花’和‘白果’葉色參數(shù)L*值的變化趨勢(shì)相同，均先上升后下降，而品種‘矮生’的L*值先下降后上升；3個(gè)品種L*值總體上變化幅度不大，‘矮生’品種葉色明亮度相較于‘八仙花’、‘白果’品種偏暗(圖1，A)。同時(shí)，3個(gè)品種在轉(zhuǎn)色期間的葉色參數(shù)a*值均呈逐漸上升趨勢(shì)，且品種間a*值差異不大，葉片顏色也均逐漸由綠轉(zhuǎn)紅；其中，‘矮生’品種a*值在10月30日前逐漸上升的趨勢(shì)較平穩(wěn)，10月30日后急劇上升(圖1，B)。另外，3個(gè)品種b*值的變化趨勢(shì)與a*值變化規(guī)律相似；品種‘八仙花’、‘白果’a*值始終高于同期品種，葉色較于‘矮生’偏黃(圖1，C)。

2.2 歐洲衛(wèi)矛葉片質(zhì)體色素含量的變化特征

由圖2可見(jiàn)，3個(gè)歐洲衛(wèi)矛品種在葉色變紅的過(guò)程中，質(zhì)體色素含量整體呈一致的下降趨勢(shì)；葉綠素a、葉綠素(a+b)含量明顯下降，葉綠素b、類胡蘿素以及葉綠素a/葉綠素b下降速率變化較為平穩(wěn)，總體上變化不大?？梢?jiàn)，歐洲衛(wèi)矛葉片葉綠素總含量的下降主要是由于葉綠素a含量的下降，這與崔珂婉的結(jié)果相一致，認(rèn)為是植物對(duì)降溫、光照時(shí)間縮短等不利環(huán)境的適應(yīng)[18]。

圖1 3個(gè)歐洲衛(wèi)矛品種葉色參數(shù)L*、a*、b*值的變化Fig.1 The changes of leaf color parameter L*, a* and b* in three E. europaea varieties

2.3 歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷相對(duì)含量及花色素苷/葉綠素、類胡蘿素/葉綠素比值的變化

3個(gè)歐洲衛(wèi)矛品種葉片中花色素苷的含量在整個(gè)轉(zhuǎn)色期不斷升高(圖3，A)。其中，花色素苷的含量在前期上升均較為緩慢，10月30日‘八仙花’和‘白果’上升較前期略快，‘矮生’從10月30日起急劇上升，這與葉色參數(shù)a*值變化趨勢(shì)相似(圖1，B)?？梢?jiàn)，歐洲衛(wèi)矛轉(zhuǎn)色初期葉色變化程度較小，后期隨著花色素苷的大量合成葉色變化較為明顯，并因花色素苷含量達(dá)到最大值而葉色相對(duì)保持不變。同時(shí)，在歐洲衛(wèi)矛葉片整個(gè)轉(zhuǎn)色過(guò)程中，花色素苷/葉綠素比值的表現(xiàn)為上升趨勢(shì)(圖3，B)，這與花色素苷含量變化趨勢(shì)基本一致，且后期上升速率增大?；ㄉ剀蘸吭黾釉诟魃乇壤姓加薪^對(duì)優(yōu)勢(shì)是歐洲衛(wèi)矛葉片變紅的直接原因。另外，歐洲衛(wèi)矛葉片類胡蘿素含量在整個(gè)轉(zhuǎn)色期間總體質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，但無(wú)明顯的變化趨勢(shì)(圖1)，其類胡蘿素/葉綠素比值總體呈下降趨勢(shì)(圖3，C)，從而可知類胡蘿素對(duì)歐洲衛(wèi)矛葉片變紅影響不大。

圖2 3個(gè)歐洲衛(wèi)矛品種葉片中質(zhì)體色素含量的變化Fig.2 The changes in plastid pigment content in leaves of three E. europaea varieties

圖3 歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷含量及花色素苷/葉綠素、類胡蘿素/葉綠素比值的變化Fig.3 The changes in anthocyanin relative content, anthocyanin/chlorophyll, carotenoid/chlorophyll in leaves of three E. europaea varieties

2.4 歐洲衛(wèi)矛葉片可溶性糖含量的變化特征

在秋冬葉片轉(zhuǎn)色期，3個(gè)歐洲衛(wèi)矛品種葉片中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先升后降的單峰曲線(圖4)，這與楚愛(ài)香等[19]結(jié)果相一致。其中，葉片可溶性糖含量在轉(zhuǎn)色初期增幅明顯，推測(cè)可能是由于初期氣溫驟降，誘導(dǎo)可溶性糖含量大幅增加。

在10月20日，各品種歐洲衛(wèi)矛葉片的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)到峰值(圖4)。相應(yīng)的‘ 八仙花’、‘白果的’品種葉片花色素苷相對(duì)含量在10月20日后上升幅度較之前略大，‘矮生’葉片花色素苷相對(duì)含量從10月30日起則急劇上升?？梢?jiàn)，各品種歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷的大量合成出現(xiàn)在其可溶性糖含量達(dá)到峰值后，說(shuō)明可溶性糖的積累可能有利于花色素苷的合成。

2.5 歐洲衛(wèi)矛品種葉片相關(guān)酶活性的變化特征

PAL(苯丙氨酸解氨酶)是花色素苷合成途徑中關(guān)鍵性的酶，其活性高低決定花色素苷含量高低，間接決定植物葉色的呈現(xiàn)[20]；同時(shí)，它在類黃酮類、木質(zhì)素等的合成過(guò)程中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[21]，能有效抵抗外界環(huán)境的干擾。由圖5，A可知，3個(gè)品種歐洲衛(wèi)矛葉片PAL活性在轉(zhuǎn)色過(guò)程中呈波動(dòng)上升趨勢(shì)。其中，‘矮生’和‘白果’的 PAL活性在葉片轉(zhuǎn)色初期增幅明顯，轉(zhuǎn)色中期呈下降趨勢(shì)，轉(zhuǎn)色中后期繼續(xù)增大，而后保持平穩(wěn)；而‘八仙花’品種PAL活性在10月20日達(dá)到最大值，之后酶活性基本保持平穩(wěn)。整體上3個(gè)品種歐洲衛(wèi)矛葉片的PAL活性在轉(zhuǎn)色期間均變化不大。

POD和PPO活性與花色素苷的降解有關(guān)，花色苷不能直接作為PPO或POD的底物，PPO和 POD 需依賴具鄰二酚結(jié)構(gòu)的其他酚類的存在才能氧化、降解花色素苷[4]。由圖5，B可知，歐洲衛(wèi)矛在葉片轉(zhuǎn)色期間POD活性整體呈下降趨勢(shì)，但3個(gè)品種間有所差別，其中，‘矮生’品種POD活性在初期下降明顯，中后期基本保持平穩(wěn)；‘八仙花’、‘白果’品種POD活性在轉(zhuǎn)色前期不斷下降，于10月20日后有所上升，最后仍呈下降趨勢(shì)。同時(shí)，由圖5，C可知，3個(gè)品種葉片的PPO活性在轉(zhuǎn)色期間變化平穩(wěn)，呈緩慢上升趨勢(shì)，且3個(gè)品種的PPO活性差異不大。

圖4 各品種歐洲衛(wèi)矛葉片可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.4 The changes in soluble sugar mass fraction in leaves of three E. europaea varieties

圖5 3個(gè)歐洲衛(wèi)矛品種葉片PAL、POD、PPO酶活性的變化Fig.5 The changes in PAL, POD and PPO activities in leaves of three E. europaea varieties

2.6 歐洲衛(wèi)矛品種葉色參數(shù)與色素的相關(guān)性分析

由表1可知，各歐洲衛(wèi)矛品種葉色參數(shù)L*、b*值與葉綠素、類胡蘿素、花色素苷含量無(wú)明顯相關(guān)性。各品種葉色參數(shù)a*值與葉綠素含量均無(wú)明顯相關(guān)性；‘矮生’品種a*值與類胡蘿素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，‘八仙花’、‘白果’品種的a*值與類胡蘿素?zé)o明顯相關(guān)性；各品種a*值與花色素苷含量均呈極顯著正相關(guān)。以上結(jié)果說(shuō)明花色素苷是葉色變紅的主導(dǎo)因素。

3 討 論

高等植物葉片中的色素主要是葉綠素(葉綠素a、葉綠素b)、類胡蘿素和花色素苷[22]。葉片的呈色與葉片細(xì)胞內(nèi)色素的種類、含量以及在葉片中的分布有關(guān)[21]。葉片色素含量的變化和比例直接影響了秋色葉樹(shù)種秋季葉色的表達(dá)。通常植物葉片呈現(xiàn)為綠色是由于葉綠素含量較高而其他的色素含量較低。隨著秋季日照時(shí)間的縮短與溫度的下降，植物葉片開(kāi)始自然衰老，從而啟動(dòng)葉綠素降解機(jī)制，而類胡蘿卜素含量相對(duì)較穩(wěn)定，所以秋季葉色多呈黃色。秋季晝夜溫差的增大，日照時(shí)間的縮短以及溫度的下降等環(huán)境因素，促進(jìn)了部分樹(shù)木花青素的合成和積累，導(dǎo)致其葉片變成紅色[23-24]。前人研究結(jié)果表明，火炬樹(shù)[19]、五葉地錦[25]、紅楓[26]、落羽杉[27]、櫸樹(shù)[28]等植物秋季葉片中花色素苷相對(duì)含量明顯增加，在各色素比例中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，是葉片變紅的直接原因。本試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，轉(zhuǎn)色期間溫度降低，歐洲衛(wèi)矛葉片光合作用受阻，使得葉綠素含量不斷下降，主要是葉綠素a含量的減少，類胡蘿素含量無(wú)明顯變化，花色素苷含量逐漸升高，且花色素苷/葉綠素的比值不斷上升，直接影響歐洲衛(wèi)矛葉色轉(zhuǎn)紅。此外，3個(gè)品種葉色參數(shù)a*值不斷上升，a*值與花色素苷呈極顯著正相關(guān)，也說(shuō)明花色素苷顯著影響著葉片的變紅。

表1 葉色參數(shù)與葉綠素、類胡蘿素、花色素苷間的相關(guān)系數(shù)

注：**表示相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.01的顯著水平Note：**denote correlation coefficients is significant at 0.01 level

研究表明，花色素苷的合成與碳水化合物的代謝有關(guān)[29-30]，特別是與可溶性糖呈顯著正相關(guān)[30]，可溶性糖還可以作為花色素苷代謝過(guò)程中的前體物質(zhì)或信號(hào)分子，促進(jìn)花色素苷的形成。本試驗(yàn)中，歐洲衛(wèi)矛各品種花色素苷的大量合成出現(xiàn)在可溶性糖達(dá)到峰值后，說(shuō)明可溶性糖的積累可能有利于花色素苷的合成。轉(zhuǎn)色初期可能由于氣溫驟降，促使可溶性糖大量積累，后期花色素苷的大量合成消耗部分可溶性糖，致使可溶性糖呈現(xiàn)先升后降的單峰曲線。這與楚愛(ài)香等[19, 29]在火炬樹(shù)、小葉雞爪槭、三角楓等植物上得到的結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明歐洲衛(wèi)矛3個(gè)品種的花色素苷與可溶性糖無(wú)顯著相關(guān)性，姜琳等[31]、許鑫科等[32]分別對(duì)櫟屬植物、紫葉加拿大紫荊的研究也得出了相同的結(jié)論。而胡靜靜[2]、榮立蘋等[33]對(duì)黃連木、三角楓的研究結(jié)果則顯示花色素苷與可溶性糖呈顯著正相關(guān)。由此可知可溶性糖對(duì)于花色素苷合成的調(diào)控較為復(fù)雜，可溶性糖對(duì)于花色素苷的合成可能并不是決定性的因素，今后可以在分子水平對(duì)于歐洲衛(wèi)矛可溶性糖是否作為信號(hào)分子方面進(jìn)行進(jìn)一步的探究。

花色素苷的合成是在一系列酶的催化下形成的，而苯丙氨酸解氨酶(PAL)是花青素合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶[3]。前人對(duì)紅櫨[3]、紅花檵木[34]、鵝耳櫪[35]、紫葉稠李[36]等植物研究發(fā)現(xiàn)，PAL活性與花色素苷含量呈正相關(guān)性。而Lister等[14]、王惠聰?shù)萚37]發(fā)現(xiàn)PAL活性與荔枝果皮中的花色素苷合成無(wú)關(guān)。本試驗(yàn)中，歐洲衛(wèi)矛3個(gè)品種的PAL活性在轉(zhuǎn)色期間緩慢波動(dòng)上升，花色素苷的含量也在上升；相關(guān)分析表明‘八仙花’品種PAL活性與花色素苷含量呈顯著正相關(guān)，‘矮生’、‘白果’品種PAL活性與花色素苷含量呈中等水平正相關(guān)，但未達(dá)到顯著水平，可見(jiàn)PAL活性升高有利于歐洲衛(wèi)矛葉片變紅。

研究表明，POD在過(guò)氧化氫(H2O2) 存在時(shí)能氧化多種酚類成褐色產(chǎn)物[38]，促進(jìn)葉片呈色，因此POD活性越高，葉片紅色素積累越多[3, 25]。吳馭帆等[35]研究發(fā)現(xiàn)鵝耳櫪花色素苷含量與POD活性呈極顯著正相關(guān)，且紅葉植株的花色素苷含量、POD活性高于綠葉植株，認(rèn)為POD可能參與并促進(jìn)了葉片花色素苷的積累，進(jìn)而影響鵝耳櫪葉片的呈色。而在本試驗(yàn)中歐洲衛(wèi)矛3個(gè)品種的POD活性在葉片轉(zhuǎn)色期間呈下降趨勢(shì)，且初期下降明顯，轉(zhuǎn)色后期略有上升，后趨于平穩(wěn)；相關(guān)分析表明，POD活性與花色素苷含量呈負(fù)相關(guān)，但不顯著，推測(cè)POD參與了花色素苷的降解，但影響不大。相反，POD活性與葉綠素含量在轉(zhuǎn)色期間均呈下降趨勢(shì)，推測(cè)POD活性與葉綠素含量有一定的關(guān)系，這與文國(guó)琴等[39]、李力等[40]的研究結(jié)果相似，認(rèn)為POD在葉片轉(zhuǎn)色期間，不僅影響葉片中多酚含量的變化，同時(shí)參與了葉綠素的降解。另外，張?jiān)鄣萚41]對(duì)李果皮研究發(fā)現(xiàn)，PPO活性與花色素苷含量具有明顯的正相關(guān)，認(rèn)為PPO可能將果皮中的酚類物質(zhì)氧化成醌，促進(jìn)了果皮呈紫色。本試驗(yàn)中，在葉片轉(zhuǎn)色期間，歐洲衛(wèi)矛3個(gè)品種的PPO活性呈緩慢上升趨勢(shì)，‘矮生’、‘白果’PPO與花色素苷含量呈顯著正相關(guān)，‘八仙花’PPO活性與花色素苷含量呈不顯著正相關(guān)，這與張?jiān)鄣难芯拷Y(jié)果相似。說(shuō)明PPO有利于歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷的合成與積累。

綜上所述，通過(guò)對(duì)3個(gè)歐洲衛(wèi)矛品種在秋冬轉(zhuǎn)色期間的葉色參數(shù)及各項(xiàng)生理指標(biāo)含量的比較分析，歐洲衛(wèi)矛秋季葉色轉(zhuǎn)紅主要是由于花色素苷相對(duì)含量大量增加，在色素中所占比值占優(yōu)勢(shì)。可溶性糖有利于花色素苷在轉(zhuǎn)色后期的大量合成。PAL、PPO有利于花色素苷的合成與積累，POD與花色素苷無(wú)顯著相關(guān)性，可能與葉綠素的降解存在一定的關(guān)系。今后可在可溶性糖及各類酶的分子水平上進(jìn)一步探討歐洲衛(wèi)矛葉片呈色機(jī)理。