周曉瑩，梁 玉，李紅麗*，高 婭，仇蘇倩，范小莉，董 智

(1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山東省土壤侵蝕與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰山森林生態(tài)站，山東泰安 271018；2 山東省林業(yè)科學(xué)研究院，濟(jì)南 250014)

菌根是土壤中菌根真菌與植物根系形成的互利共生的聯(lián)合體，是自然界中一種普遍存在的真菌和植物共生的現(xiàn)象[1-2]。植物根際的許多真菌能入侵植物根系并形成不同類型的菌根[3]。菌根真菌可在宿主植物根部形成共生結(jié)構(gòu)[1]，以此增加宿主植物對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素和水分吸收、利用[4-9]以及碳水化合物代謝[10]，促進(jìn)植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的提高[8-14]，增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的忍耐性，增強(qiáng)抗旱、抗鹽能力，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[15-18]。特別值得一提的是，菌根真菌侵染能誘導(dǎo)植物根系發(fā)生明顯變化，改變植株根系構(gòu)型，使根系分支增加，從而促進(jìn)更多側(cè)根的形成，增加根長(zhǎng)和直徑[19-21]。大量的研究表明，利用優(yōu)良的菌根真菌進(jìn)行接種，培育菌根化苗可以增加植物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收，提高植物抗逆性，并促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育。

雙色蠟?zāi)?Laccariabicolor)屬于擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、口蘑科(Tricholomataceae)、蠟?zāi)?Laccaria)的外生菌根真菌[22]。這種真菌分布于世界各地，在森林苗圃[23]和成熟的林分[24]都很常見(jiàn)，能夠定殖于植物根部，促進(jìn)植物側(cè)根形成[25]，增加植物對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，對(duì)宿主植物具有顯著的促生效應(yīng)[26-27]，它還能夠提高植物對(duì)重金屬等非生物逆境的抵抗能力[27]，是一種優(yōu)良的外生菌根真菌，但國(guó)內(nèi)對(duì)雙色蠟?zāi)⒌难芯枯^少。

黑松(Pinusthunbergii)是一種耐鹽堿、抗逆性較強(qiáng)的樹(shù)種，是暖溫帶海岸防護(hù)林建設(shè)中常用的常綠針葉樹(shù)種[28]。但是，黑松幼苗期生長(zhǎng)緩慢，而人工接種菌根菌可以有效地提高苗期的生長(zhǎng)、造林成活率和苗木質(zhì)量[29]。1992年法國(guó)開(kāi)發(fā)了一個(gè)研究項(xiàng)目，通過(guò)接種雙色蠟?zāi)?lái)促進(jìn)花旗松(Pseudotsugamenziesii)的生長(zhǎng)[30]；2000年，雙色蠟?zāi)⒌腟238N菌株在法國(guó)商業(yè)上應(yīng)用于苗圃和森林種植園中花旗松的接種，這種菌株可以使木材總產(chǎn)量增加60%[31]。但接種雙色蠟?zāi)⒛芊翊龠M(jìn)黑松幼苗的生長(zhǎng)、根系發(fā)育？其接種后何時(shí)發(fā)揮作用？其促生作用是否持續(xù)加強(qiáng)？對(duì)于這些問(wèn)題的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。基于此，本研究以黑松為材料，探討其接種雙色蠟?zāi)⒑笠欢螘r(shí)間內(nèi)的地上部分與根系的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)及根系形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化，以期揭示雙色蠟?zāi)?duì)黑松生長(zhǎng)的影響，觀測(cè)雙色蠟?zāi)l(fā)揮作用的時(shí)間及其生長(zhǎng)效應(yīng)，為雙色蠟?zāi)⒃诤谒捎缟系膽?yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樹(shù)種為黑松，種子來(lái)源于山東乳山市垛山林場(chǎng)。供試菌種為外生真菌雙色蠟?zāi)?，引自于加拿大阿爾伯塔大學(xué)，經(jīng)培養(yǎng)后，將液體菌劑用攪拌機(jī)打碎用于實(shí)驗(yàn)接種。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

黑松種子利用90%的酒精和0.2%的HgCl2清洗10 s，然后用無(wú)菌的去離子水反復(fù)沖洗，再將種子置于滅菌培養(yǎng)皿的無(wú)菌濾紙上進(jìn)行催芽處理，催芽期間用無(wú)菌的去離子水浸潤(rùn)種子保證其催芽所需濕度。將培養(yǎng)皿放置于智能人工氣候培養(yǎng)箱中催芽，溫度25 ℃。

試驗(yàn)于2017年4～9月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)實(shí)驗(yàn)站溫室中進(jìn)行，4月20日，用消毒液及紫外線殺菌燈管對(duì)溫室及營(yíng)養(yǎng)杯進(jìn)行消毒滅菌，營(yíng)養(yǎng)杯高18 cm、直徑9 cm。培養(yǎng)基質(zhì)以泥炭土與珍珠巖3∶1混合，經(jīng)高溫高壓滅菌2 h后裝入營(yíng)養(yǎng)杯中。試驗(yàn)共設(shè)置接菌(接種雙色蠟?zāi)?，文中用LB代替，下同)和不接菌對(duì)照(CK) 2個(gè)處理。將催芽露白的黑松種子播入營(yíng)養(yǎng)杯，待黑松出苗后，立即分別接種培養(yǎng)好的打碎的雙色蠟?zāi)⒁后w菌劑，接種量為每營(yíng)養(yǎng)杯每次10 mL菌液，對(duì)照不接菌，每處理100株苗。1個(gè)月后重復(fù)接種1次。所有試驗(yàn)苗均在25 ℃溫室中培養(yǎng)，期間用25%的 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液作為黑松的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，接種前后2周不澆營(yíng)養(yǎng)液，光照和澆水等管理措施一致。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1侵染率參照常雙雙等的臺(tái)盼藍(lán)染色[32]方法，于接種黑松2個(gè)月后測(cè)定侵染率，其侵染率為34.55%，對(duì)照沒(méi)有侵染。

1.3.2生長(zhǎng)量與根系形態(tài)參數(shù)各處理于接菌后15 d測(cè)定第1次株高，其后分別于30 d、60 d、90 d、120 d測(cè)定株高。同時(shí)，隨機(jī)選擇幼苗10株帶回實(shí)驗(yàn)室，把幼苗從營(yíng)養(yǎng)杯中全部取出，盡量不傷害根系，經(jīng)自來(lái)水清洗后，從根莖處將幼苗分成地上植株和根系兩部分；立即于EPSON 平板掃描儀掃描完整的根系，獲得根系圖片，采用 WinRhizo根系分析儀測(cè)定長(zhǎng)度、表面積、體積、分支數(shù)等根系形態(tài)參數(shù)。測(cè)定完成后，將地上部分和根系于80 ℃烘干12 h后稱得干重。

雙色蠟?zāi)?duì)植物生長(zhǎng)的作用可用其生物量的積累效應(yīng)—生長(zhǎng)效應(yīng)(mycorrhizal growth response，MGR)表示，其計(jì)算公式[33]為：

MGR(%)=100×(BA-BNA)/BNA

其中，BA表示接種雙色蠟?zāi)⒑笾参锏纳锪浚珺NA表示不接種雙色蠟?zāi)r(shí)植物的生物量。MGR>0表示雙色蠟?zāi)⒋龠M(jìn)了植物的生長(zhǎng)，MGR<0表示雙色蠟?zāi)⒁种屏酥参锏纳L(zhǎng)，MGR= 0表示雙色蠟?zāi)?duì)植物生長(zhǎng)沒(méi)有影響。

另外，根系分形維數(shù)采用王義琴等的方法[34]計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS19.0對(duì)黑松生長(zhǎng)量和根系參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與ANOVA方差分析，并且檢驗(yàn)處理間差異的顯著性，顯著性水平α=0.05。采用Excel 2010進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種雙色蠟?zāi)?duì)黑松株高和生物量的影響

表1顯示，接種雙色蠟?zāi)?5和30 d，接種黑松幼苗株高與對(duì)照組差異不明顯(P>0.05)，接種30 d較對(duì)照增加11.58%；接種60～120 d，雙色蠟?zāi)@著地促進(jìn)了黑松株高的生長(zhǎng)，接種處理株高比對(duì)照組顯著增加29.08%～74.04%(P<0.05)?？梢?jiàn)，接種雙色蠟?zāi)?duì)黑松幼苗株高生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，該效應(yīng)隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。

同時(shí)，由表1還可知，黑松接種雙色蠟?zāi)⒌?5和30天時(shí)，接菌處理地上部生物量與對(duì)照組均沒(méi)有顯著差異；從接種后第60天開(kāi)始，雙色蠟?zāi)?duì)黑松地上部分的生物量產(chǎn)生了顯著的促進(jìn)作用 (P<0.05)，在接種第60～120天時(shí)生長(zhǎng)效應(yīng)為100.00%～195.00%。另外，接種黑松根系生物量在第15天時(shí)就高于對(duì)照組，但與對(duì)照差異不顯著；在接種第30～120天時(shí)，雙色蠟?zāi)⑻幚淼暮谒筛瞪锪烤@著高于對(duì)照組(P<0.05)，期間雙色蠟?zāi)?duì)黑松根系生長(zhǎng)的促進(jìn)作用上升比較平穩(wěn)，較對(duì)照平均增長(zhǎng)91%。整體來(lái)看，接種雙色蠟?zāi)?duì)黑松生物量的促進(jìn)作用同樣隨接種時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)增長(zhǎng)。

2.2 接種雙色蠟?zāi)?duì)黑松根系形態(tài)、根長(zhǎng)和根系分支數(shù)的影響

圖 1顯示， 在接種雙色蠟?zāi)?5～120 d期間，接種雙色蠟?zāi)⑻幚砗谒捎酌缰鞲L(zhǎng)度、側(cè)根長(zhǎng)度、總根長(zhǎng)、根系的分支數(shù)等根系構(gòu)型均明顯優(yōu)于未接種的對(duì)照。首先，接種的黑松苗總根長(zhǎng)在各個(gè)生長(zhǎng)階段中均不同程度大于未接種對(duì)照(圖2，A)，其在接種第15天時(shí)就開(kāi)始表現(xiàn)出與對(duì)照組的顯著差異(P<0.05)，在接種第90d～120天時(shí)總根長(zhǎng)增長(zhǎng)量較大，并于第120天時(shí)總根長(zhǎng)達(dá)到最大(303.55 cm)，遠(yuǎn)大于現(xiàn)未接種CK(141.84 cm)。其次，接種雙色蠟?zāi)⒑谒捎酌绺捣种?shù)從第60天開(kāi)始也顯著高于不接種對(duì)照(圖2，B)，其于接菌后90～120 d期間根系分支數(shù)增長(zhǎng)量最大，接種第120天時(shí)根系分支數(shù)(1 218.33)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CK(410.00)。

表1 不同處理下黑松株高和干生物量的動(dòng)態(tài)變化

注：CK.不接菌對(duì)照；LB.接種雙色蠟?zāi)?MGR.生長(zhǎng)效應(yīng)；同行不同小寫字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異 (P<0.05)；下同Note: CK. Without inoculation; LB. Inoculation withLaccariabicolor; MGR. Mycorrhizal growth response; Different small letters within same row meant significant difference between treatments at 0.05 level (P<0.05). The same as below

圖1 不同處理下黑松根系構(gòu)型Fig.1 Root system architecture of P. thunbergii seedlings under different treatments

圖中不同小寫字母表示同期處理間差異顯著(P<0.05)，下同。圖2 不同處理下黑松幼苗根系總根長(zhǎng)和分支數(shù)Different small letters within same stage meant significant difference among treatments at 0.05 level. The same as below.Fig.2 Total root length and forks of P. thunbergii seedling under different treatments

2.3 雙色蠟?zāi)?duì)黑松根系表面積和體積的影響

不同處理根系表面積的變化趨勢(shì)與總根長(zhǎng)基本一致(圖3，A)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，接種雙色蠟?zāi)⑻幚砗谒捎酌绲母当砻娣e均不同程度高于未接種對(duì)照，其在接種15 d后就開(kāi)始與對(duì)照組產(chǎn)生了顯著的差異(P<0.05)，并隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)均始終顯著大于對(duì)照組。同時(shí)。在接種處理?xiàng)l件下，黑松幼苗根體積隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大(圖3，B)。與不接種的對(duì)照組相比，接種處理根系體積在黑松生長(zhǎng)各時(shí)間點(diǎn)均不同程度大于不接種對(duì)照；接種處理黑松苗根系體積在接種第15天時(shí)與對(duì)照組相比差異不顯著，從接種第30天時(shí)起與對(duì)照組產(chǎn)生了顯著的差異(P<0.05)，其在接種第120天時(shí)根系體積(0.898 0 cm3)顯著大于未接種CK(0.312 3 cm3)。

2.4 雙色蠟?zāi)?duì)黑松根系分形特征的影響

植物根系形態(tài)的分形維數(shù)直接反映了植物根系在不同生長(zhǎng)環(huán)境影響下發(fā)育程度的差異[35]。植物根系越發(fā)達(dá)，分支越多，分形維數(shù)越高，而較小的分形維數(shù)反映出根系的分生能力相對(duì)較弱[36-37]。從圖4可知，接種處理和對(duì)照黑松幼苗根系分形維數(shù)均隨著接種時(shí)間逐漸增加，但接種雙色蠟?zāi)⑻幚砭绺捣中尉S數(shù)在接種后不同時(shí)期均不同程度高于未接種對(duì)照(P<0.05)，其在接種后15 d、30 d時(shí)與對(duì)照組分形維數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)，而其從接種第60～120天根系分形維數(shù)均顯著高于對(duì)照組。說(shuō)明接種雙色蠟?zāi)⒋龠M(jìn)了黑松根系主根與側(cè)根的生長(zhǎng)，使根系變得更為發(fā)達(dá)。

圖3 不同處理下黑松幼苗根系表面積和體積Fig.3 Total root surface area and volume of P. thunbergii seedling under different treatments

圖4 不同處理下黑松幼苗根系的分形維數(shù)Fig.4 Fractal dimension of root of P. thunbergii seedlings under different treatments

3 討 論

研究表明，雙色蠟?zāi)⒛艽龠M(jìn)植物的生長(zhǎng)，辜夕容等證實(shí)雙色蠟?zāi)?duì)馬尾松幼苗具有促生作用，能顯著促進(jìn)馬尾松幼苗生長(zhǎng)、增加養(yǎng)分吸收，并且接種雙色蠟?zāi)⒉粌H具有促進(jìn)生長(zhǎng)和改善營(yíng)養(yǎng)的作用，還可以提高馬尾松幼苗的抗鋁能力[22]。Selosse等研究發(fā)現(xiàn)，與未接種的自然菌根樹(shù)木相比，接種雙色蠟?zāi)⒖梢允够ㄆ焖赡静目偖a(chǎn)量增加60%[31]。本研究表明，在雙色蠟?zāi)⑴c黑松互作過(guò)程中，能夠成功定殖于黑松根部，接種雙色蠟?zāi)⒋龠M(jìn)了黑松幼苗地上植株、地下根系的生長(zhǎng)及其生物量的積累，表現(xiàn)出明顯的促生作用；在幼苗地上部分生物量、株高、根系分支數(shù)、分形維數(shù)等方面，其在接種后15 d和30 d時(shí)與對(duì)照組相比差異并不顯著，但各個(gè)指標(biāo)從接種后60 d開(kāi)始顯著受到促進(jìn)作用；在根系生物量、根系體積方面，其在接種第30天時(shí)表現(xiàn)出與對(duì)照組的顯著差異；而在根長(zhǎng)、根系表面積方面，接種后15 d就與對(duì)照組產(chǎn)生了顯著的差異。雙色蠟?zāi)⒖梢源龠M(jìn)黑松的生長(zhǎng)，且在對(duì)黑松苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用上，對(duì)根系發(fā)育的顯著促進(jìn)作用早于地上部分。這可能與雙色蠟?zāi)⒖梢援a(chǎn)生生長(zhǎng)素類物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)[38]。

根系是植物從土壤中吸收水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的重要器官，良好的根系可促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，而根系形態(tài)可以直接反映根系的生長(zhǎng)情況[39]。接種雙色蠟?zāi)⒑?，與對(duì)照相比，黑松幼苗根系形態(tài)參數(shù)都發(fā)生了明顯的變化。已有研究發(fā)現(xiàn)，菌根真菌與宿主植物形成菌根共生體之后，有利于根系碳庫(kù)的積累，特別是葡萄糖含量的提高，這為根系發(fā)育提供了代謝底物，有利于根系構(gòu)型的建立[10]，可以誘導(dǎo)植物根系形態(tài)發(fā)生顯著變化[21]，造成根系分支數(shù)增多，使根系形成更高級(jí)的次根，增加根長(zhǎng)和直徑[19-21]。吳小芹等[40]發(fā)現(xiàn)，接種菌根菌后可促進(jìn)黑松主根長(zhǎng)、側(cè)根總級(jí)數(shù)、分支數(shù)等根系參數(shù)不同程度地增加。本研究表明，接種雙色蠟?zāi)⒌暮谒捎酌绺敌螒B(tài)參數(shù)如根系總長(zhǎng)度、分支數(shù)、表面積和體積顯著高于不接種菌根菌的對(duì)照，并使根系分形維數(shù)增大，且所有參數(shù)在接種120 d時(shí)均表現(xiàn)為接種處理大于未接種處理。這說(shuō)明雙色蠟?zāi)⒛艽龠M(jìn)黑松幼苗根系形態(tài)的構(gòu)建，具有正向促進(jìn)效應(yīng)，且隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，其促進(jìn)作用更加明顯。雙色蠟?zāi)⑹垢底兊冒l(fā)達(dá)，增加了根系的表面積和體積。

綜上所述，雙色蠟?zāi)⒛軌虺晒Χㄖ秤诤谒筛?，促進(jìn)了黑松幼苗地上、地下部的生長(zhǎng)及其生物量的積累，同時(shí)顯著促進(jìn)根系形態(tài)參數(shù)如根系總長(zhǎng)度、分支數(shù)、表面積和體積增加，并使根系分形維數(shù)增大，表現(xiàn)出明顯的促生作用，且雙色蠟?zāi)?duì)黑松幼苗根系發(fā)育的顯著促進(jìn)作用早于地上部分。這可能與雙色蠟?zāi)a(chǎn)生的促進(jìn)植物生長(zhǎng)的激素首先與根系接觸有關(guān)，這需要在今后深入研究各時(shí)間段的侵染率、養(yǎng)分、激素的動(dòng)態(tài)變化狀況等，進(jìn)一步闡明雙色蠟?zāi)?duì)黑松的促生作用機(jī)理。