宋曉環(huán)

(長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理教研室，吉林 長(zhǎng)春 131300)

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，與高危型人乳頭狀病毒(HPV)感染密切相關(guān)，發(fā)病率僅次于乳腺癌〔1,2〕。近年相關(guān)文獻(xiàn)〔3～6〕報(bào)道內(nèi)皮特異性分子(ESM)-1和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)都與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究探索ESM-1和VEGF是否參與宮頸癌的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1對(duì)象與分組 選取2016～2018年經(jīng)吉林省人民醫(yī)院病理科確診的宮頸癌組織150例和癌旁宮頸組織30例作為研究對(duì)象，平均年齡分別為(52.6±1.4)歲和(53.3±1.9)歲。宮頸癌組織根據(jù)臨床分期：Ⅰ期51例、Ⅱ期59例、Ⅲ期40例，根據(jù)病理類型：高分化62例、中分化45例、低分化43例，根據(jù)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移63例、無(wú)轉(zhuǎn)移87例。全部病例在術(shù)前均未接受任何放、化療，不合并其他臟器官疾病，兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)。

1.2主要試劑和儀器 兔抗人ESM-1、VEGF抗體、SP9710和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購(gòu)于福州邁新生物有限公司。Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)于塔克拉公司。Leica切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；OLYMPUS BX51光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3ESM-1和VEGF mRNA水平檢測(cè) 首先設(shè)計(jì)、合成引物，由上海生物工程有限公司合成，序列為GADPH引物(371 bp)：上游5′-GATTGTTGCCATC-AACGACC-3′,下游5′-GTGCAGGATGCATTGCTGAC-3′；ESM-1引物(523 bp)：上游5′-AACTATGCTGAAGTCTTAGGA-3′,下游5′-TCAGAACTGAGTAAGGCCTG-3′；VEGF引物(287 bp)：上游5′-TGGGCCAGCAATTGTTCACA-3′,下游5′-ATTGTCTTGCCATCATGCTAG-3′。Trizol提取總RNA然后反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)預(yù)變性、變性、退火、延伸及40個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)得Ct值，每個(gè)樣本基因擴(kuò)增3次，取平均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)水平，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。

1.4樣本中ESM-1、VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度的檢測(cè) 組織石蠟切片3 μm，每個(gè)樣本2張，65℃烤箱烘片2 h，然后常規(guī)脫蠟至水洗，采用檸檬酸抗原修復(fù)液煮沸10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，分別滴加ESM-1、VEGF抗體，抗體為即用型，其余步驟嚴(yán)格按照SP9710試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，DAB顯色后，用蘇木精復(fù)染，封片。OLYMPUS顯微鏡觀察，200倍鏡下拍攝圖片連續(xù)5個(gè)視野，采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析軟件，檢測(cè)光密度值(OD值)，OD值越大陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組ESM-1和VEGF mRNA水平比較 與癌旁宮頸組織比較，ESM-1和VEGF mRNA水平隨宮頸癌分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期表達(dá)明顯增強(qiáng)，隨宮頸癌病理類型高、中、低分化表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組ESM-1和VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度比較 與癌旁宮頸組織比較，ESM-1和VEGF的蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度隨宮頸癌分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期表達(dá)明顯增強(qiáng)，隨宮頸癌病理類型高、中、低分化表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1，圖2。

2.3ESM-1和VEGF陽(yáng)性表達(dá)率和臨床病理特征的關(guān)系 ESM-1和VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率在不同臨床分期、病理類型及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 三組ESM-1、VEGF mRNA及蛋白水平的比較

與癌旁宮頸組織比較：1)P<0.05；與Ⅰ期比較：2)P<0.05；與Ⅱ期比較；3)P<0.05，與高分化比較:4)P<0.05；與中分化比較:5)P<0.05

圖1 各組ESM-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度(×200，免疫組化SP法染色)

圖2 各組VEGF蛋白的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度(×200，免疫組化SP法染色)

臨床病理特征nESM-1+-陽(yáng)性率(%)VEGF+-陽(yáng)性率(%)臨床分期Ⅰ期512526 49.0224 2747.06Ⅱ期593920 66.101) 362361.021)Ⅲ期4037392.501)2)35587.501)2)病理類型高分化6227 3543.5525 3740.32中分化4534 1175.563)321371.113)低分化4340 393.023)4)38588.373)4)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有63 59493.6556788.89 無(wú)87 424548.285) 394844.835)

與Ⅰ期比較:1)P<0.05；與Ⅱ期比較:2)P<0.05；與高分化比較:3)P<0.05；與中分化比較:4)P<0.05；與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較:5)P<0.05

2.4ESM-1和VEGF mRNA水平及蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性分析 ESM-1和VEGF mRNA水平及蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度均呈正相關(guān)(r1=0.529，P1=0.026；r2=0.601，P2=0.035)。

3 討 論

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，僅次于乳腺癌，其發(fā)病率逐年年輕化且發(fā)病率、死亡率高，嚴(yán)重威脅女性患者的生命健康和生活質(zhì)量〔1,2〕。近年來(lái)手術(shù)治療雖然有一定的效果，但中、晚期患者術(shù)后仍易于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，因此尋找新的治療手段是腫瘤專家的熱衷研究課題。ESM-1是1996年從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫(kù)中克隆出的一種新型內(nèi)皮細(xì)胞，是一種可溶性蛋白多糖，具有調(diào)節(jié)VEGF的功能〔2～4,7〕。眾多研究〔8,9〕證實(shí)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)與腫瘤新生血管密切相關(guān)。ESM-1既能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)又能改善腫瘤細(xì)胞微環(huán)境〔7,10〕；VEGF是促血管生成因子，具有多功能性，能直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)血管生成，還能介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)血管生成〔11～13〕。因此，ESM-1、VEGF與腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究成為熱點(diǎn)，探索ESM-1、VEGF能否成為腫瘤靶向治療的靶點(diǎn)備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ESM-1和VEGF參與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)，阻斷二者的表達(dá)可能為宮頸癌靶向治療提供新的指導(dǎo)與靶點(diǎn)。

4 參考文獻(xiàn)

1李 倩,徐伏蘭,周 琦,等.內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子1在宮頸癌組織中表達(dá)及臨床意義〔J〕.國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志,2013;40(5):464-6.

2Kim K,Ryu SY.Major clinical research advances in gynecologic cancer 2009〔J〕.J Gynecol,2009;20(4):203-9.

3龍 馳,張 濛,張明慧,等.內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1與人類腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2013;21(5):1162-5.

4陳超陽(yáng),陳維榮.內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子1與腫瘤研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述,2011;17(12):1806-8.

5仲維蘭,魯美鈺,司春楓,等.乳腺癌靶向治療研究〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2018;4(26):622-6.

6胡 泓,龔 柳,孫秀萍.老年胃癌患者血清腫瘤標(biāo)志物及細(xì)胞因子的表達(dá)及意義〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2018;38(6):1357-9.

7劉秋梅,李 博,金鳳表,等.內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1與微血管心絞痛的研究進(jìn)展〔J〕.心血管病學(xué)進(jìn)展,2018;2(39):286-90.

8李 芳,李玉鳳,張景華.微小RNA通過(guò)調(diào)控腫瘤血管形成影響腫瘤轉(zhuǎn)移〔J〕.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2015;11(34):2332-7.

9李曉霞,李文良,馬勇杰.肺癌腦轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2013;20(5):387-91.

10向 昕,趙文博.內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008;36(6):67-71.

11龔曉燕,保永亮,黃金玲.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移〔J〕.安徽醫(yī)藥,2013;17(1):3-5.

12張東梅,卿 晨.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族及其受體與腫瘤〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述,2017;3(23):417-20,427.

13王立巖,許曉艷,盛敏佳,等.HIF-1α及VEGF在宮頸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2009;13(12):1749-52.