劉俊杰 王婧瑤 梁文吉 王一超 張婧曦 孫竹梅 趙 旭 趙雅寧 李建民

(華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000)

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)致殘率高、發(fā)病多見于中青年，嚴(yán)重威脅人類健康和生命。隨著臨床診療技術(shù)的提高，患者的存活率顯著提高，但存活下來的患者約20%伴有認(rèn)知功能障礙〔1,2〕。自噬是指通過對(duì)蛋白質(zhì)聚集體，長(zhǎng)壽命蛋白及受損細(xì)胞器的降解和回收利用以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細(xì)胞代謝過程，其在饑餓、缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體損傷及使用一些藥物干預(yù)時(shí)均可被誘導(dǎo)激活，是促進(jìn)細(xì)胞存活的重要機(jī)制〔3〕。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SAH在造成神經(jīng)損傷的同時(shí)也會(huì)改變自噬過程，且自噬主要發(fā)生于神經(jīng)細(xì)胞中〔4〕。內(nèi)皮素(ET)A受體屬于7次跨膜耦聯(lián)G-蛋白受體的超家族，文獻(xiàn)報(bào)道，SAH后可發(fā)現(xiàn)ETA的高表達(dá)〔5〕。因此ETA成為可能的藥物調(diào)控靶點(diǎn)。ET受體(ETR)拮抗劑BQ-123是一類高特異性親和力，可與ET競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ETA受體〔6〕。本研究應(yīng)用BQ-123ETA對(duì)SAH大鼠進(jìn)行治療性干預(yù)，觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶功能改變及神經(jīng)細(xì)胞自噬的水平。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及分組 144只SPF級(jí)雄性SD大鼠(體重350～400 g)，購自華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司〔動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2016-003〕。飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)研究中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，自由進(jìn)食水。所有實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)華北理工大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將144只大鼠分為Sham組、SAH組、BQ-123組，每組再按取材時(shí)間點(diǎn)不同，隨機(jī)分為6、24、72、144 h亞組(n=12)。

1.2主要試劑與儀器 多克隆Beclin-1和LC3-Ⅱ一抗(美國(guó)Santa Cruz公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)及檸檬酸鹽緩沖液(武漢博士德)，大鼠腦立體定位儀(深圳瑞沃德)，OLYMPUS攝像顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，圖像采集及分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué))。

1.3SAH模型制備及給藥 如文獻(xiàn)所述〔7〕，采用經(jīng)典自體血枕大池二次注血法：采股動(dòng)脈非抗凝動(dòng)脈血0.3 ml，頸后正中切口，暴露環(huán)枕膜，刺破環(huán)枕膜向枕大池注射自體動(dòng)脈血，48 h后重塑一次。Sham組只手術(shù)暴露，不進(jìn)行環(huán)枕膜穿刺及枕大池注射，余操作均與SAH組完全一致。模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)：①注射成功后可以觀察到大鼠呼吸、心率的加快，肌肉抽搐；②腦組織大體標(biāo)本可在腦基底節(jié)區(qū)看到散在血凝塊。BQ-123組：據(jù)Paxinos-Watson腦定位圖，以前囟為零點(diǎn)，調(diào)節(jié)腦定位儀(AP:-0.8 mm;ML:1.5 mm;DV:3.3 mm)并標(biāo)記。于標(biāo)記點(diǎn)鉆直徑0.5 mm骨孔，微量注射器緩慢地注射BQ-123到側(cè)腦室。劑量：18 μg，5 μl。

1.4行為學(xué)檢測(cè) 各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別置入穿梭箱內(nèi)，實(shí)驗(yàn)開始前暗適應(yīng)5 min，隨后給予5 s的鈴聲刺激，再立即予以30 s電刺激，中間隔開20 s行下一次練習(xí)。試驗(yàn)中大鼠受到鈴聲刺激5 s內(nèi)，能夠迅速逃離危險(xiǎn)區(qū)，則被界定為一次主動(dòng)回避反應(yīng)；若鈴聲刺激5 s,大鼠未逃離危險(xiǎn)區(qū)，則再次予以30 s電刺激，如果此時(shí)大鼠逃向安全位置，計(jì)為1次被動(dòng)回避反應(yīng)。連續(xù)記錄30次，收錄遭受電擊時(shí)間-被動(dòng)回避潛伏期(PAL)、主動(dòng)回避反應(yīng)次數(shù)。計(jì)算主動(dòng)回避反應(yīng)次數(shù)占總訓(xùn)練次數(shù)的百分比即為主動(dòng)回避反應(yīng)率(AARR)。AARR越高，PAL越短，提示動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)，反之則越弱〔8〕。

1.5病理學(xué)檢測(cè) 各時(shí)間點(diǎn)取5只大鼠，提前預(yù)冷的PBS緩沖液灌注，再用4%的多聚甲醛溶液灌注固定，固定后迅速取腦，多聚甲醛溶液中固定48 h，截取視交叉平面以后至大腦橫裂以前段腦組織，冠狀切割為3份，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，切片，切片厚度為4 μm，進(jìn)行HE染色。400倍顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化，并計(jì)數(shù)存活神經(jīng)元個(gè)數(shù)。

1.6Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫組織化學(xué)染色 切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽高壓熱修復(fù)，分別滴加Beclin-1多克隆抗體(濃度1∶200)、LC3-Ⅱ多克隆抗體(濃度1∶300)，4℃孵育過夜；滴加二抗，37℃溫箱孵育30 min，DAB顯色，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。PBS代替一抗陰性對(duì)照，400倍顯微鏡下觀察海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)變化并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad Prism7.0建立數(shù)據(jù)庫進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析、SNK法。

2 結(jié) 果

2.1BQ-123對(duì)SAH大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響 與Sham組比較，SAH組大鼠對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍，各時(shí)間點(diǎn)AARR均值顯著降低，PAL時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；與SAH組比較，BQ-123組大鼠反應(yīng)較為靈敏，能夠有效躲避電擊，各時(shí)間點(diǎn)AARR顯著升高，PAL時(shí)間顯著縮短(P<0.05)。見表1，表2。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)AARR比較

與Sham組比較：1)P<0.05；與SAH組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PAL比較

2.2BQ-123對(duì)SAH大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響 Sham組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)整，細(xì)胞核飽滿，近似圓形，核仁清晰。SAH組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)深染，胞核邊界不清，核固縮、碎裂，核溶解，三角形的死亡細(xì)胞形態(tài)，其中正常形態(tài)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較Sham組明顯減少(P<0.05)；而BQ-123組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)損傷程度明顯減輕，與SAH組比較，BQ-123組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量均明顯增多(P<0.05),見圖1，表3。

圖1 各組大鼠24 h海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)變化(HE，×400)

組別6 h24 h72 h144 hSham組132.00±1.90132.50±1.37132.83±2.23132.83±2.13SAH組75.17±1.941)87.50±2.591)96.00±2.191)103.17±1.941)BQ-123組87.00±2.832)103.17±1.472)109.83±2.312)114.33±2.582)

2.3BQ-123對(duì)自噬因子的影響 Sham組大鼠海馬CA1區(qū)Beclin-1、LC3-Ⅱ?yàn)槿蹶栃员磉_(dá)，偶可見陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞的胞質(zhì)呈棕黃色淡染；與Sham組比較，SAH組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，且呈強(qiáng)陽性表達(dá)，胞質(zhì)呈深棕黃色(P<0.05)；BQ-123組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)Beclin-1、LC-3Ⅱ蛋白表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)量均較SAH組增多(P<0.05)，見圖2，表4，表5。

圖2 各組24 h海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞Beclin-1及LC3-Ⅱ的表達(dá)(DAB，×400)

組別6 h24 h72 h144 hSham組23.83±1.3324.33±1.0323.67±1.3723.50±1.05SAH組31.00±1.411)45.33±2.341)37.17±2.141)30.33±2.581)BQ-123組 42.17±1.942) 58.00±0.632) 49.50±2.172) 37.17±1.942)

表5 各組大鼠海馬區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)LC3-Ⅱ表達(dá)結(jié)果個(gè)/高倍視野)

3 討 論

AARR和PAL能客觀地反映大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。本研究結(jié)果提示，SAH后大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能受損，而BQ-123治療后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有明顯改善。BQ-123可以與ET-1結(jié)合，緩解血管痙攣、抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)及腎素-血管緊張素系統(tǒng)的活性〔9〕。文獻(xiàn)報(bào)道，腦缺血再灌注損傷中BQ-123在血漿中與ET競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ETAR，進(jìn)而緩解血管收縮，抑制血管痙攣，改善組織灌注壓，使細(xì)胞缺血缺氧得到相應(yīng)改善〔10〕，因此，BQ-123可以減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡，從而使學(xué)習(xí)記憶功能得到了改善。

本研究顯示SAH組大鼠海馬區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)目明顯下降，而BQ-123組神經(jīng)細(xì)胞的損害明顯減少，BQ-123可以提高SAH后大鼠海馬區(qū)Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)水平，增強(qiáng)自噬激活的程度，同時(shí)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞丟失數(shù)量明顯減少。張?jiān)茤|等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)BQ-123組可明顯緩解腦血管痙攣，改善腦部血液流量。BQ-123的干預(yù)作用，使ET-1不能同ETA有效結(jié)合，不能有效水解磷脂酰肌醇，減少了鈣離子釋放，改善腦組織的血供〔10〕。而大量的ET-1與ETB的受體結(jié)合，釋放內(nèi)源性一氧化氮，緩解血管痙攣，舒張血管，緩解腦組織缺血缺氧的狀態(tài)。Ceylan-Isik等〔12〕報(bào)道，ET-1能夠降低Beclin-1表達(dá)下調(diào)，降低自噬的活性，BQ-123處理可以提高心肌細(xì)胞自噬的活性，ET-1與自噬存在密切調(diào)控關(guān)系。本研究顯示，BQ-123可能是與ET-1競(jìng)爭(zhēng)ETA受體，緩解腦血管痙攣，改善腦組織缺血缺氧，從而改變自噬的活化狀態(tài)，減輕海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞丟失，從而改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。但BQ-123對(duì)自噬的調(diào)控機(jī)制及相關(guān)靶點(diǎn)本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行深入探討，我們將作為后續(xù)研究的方向。

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