李海燕 孫 靜 楊亞娟 張逍港

(西安醫(yī)學院醫(yī)學技術系，陜西 西安 710000)

肝纖維化是肝臟組織在各種病因的損傷下發(fā)生的一種可逆的損傷修復反應，以細胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積為特點，肝星狀細胞(HSC)是ECM的主要來源。若肝纖維化得不到有效控制，最終會進展為肝硬化。在我國，乙肝病毒(HBV)感染是導致肝炎、肝硬化的主要病因。研究表明〔1，2〕，HBV編碼的X(HBx)蛋白在肝纖維化的啟動和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。NADPH 氧化酶(NOX)的多種亞基如NOX1、NOX2、NOX4，通過生成活性氧簇(ROS)介導了氧化應激反應，在HSC活化中發(fā)揮了重要作用〔3～5〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1在各種類型的肝纖維化中，是最強的致纖維化的細胞因子。為證實HBx蛋白是否能夠活化HSC及通過何種分子活化HSC，本研究將HBx-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染入L02肝細胞株，構建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx的L02-HBx細胞株，隨后制備L02-HBx、LX-2/L02-pcDNA3.1、 LX-2/L02的條件培養(yǎng)基，分別孵育HSC株LX-2。檢測HSC活化標志物α-SMA、TGF-β1和NOX4的蛋白表達，進一步揭示其分子機制，探討HBx蛋白對HSC的活化和NOX分子表達的影響及TGF-β1在這個過程中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑 人HSC株LX-2、人肝細胞株L02由中科院上海細胞庫提供；細胞孵育于培養(yǎng)基(由RPMI1640、10%小牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 kU/L青霉素配制而成)，放置于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱(37℃)，實驗取用對數(shù)生長期細胞。pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒(西安依科生物有限公司)、NOX4 siRNA(上海吉瑪制藥技術有限公司)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國 Pierce公司)、潮霉素B、SB-431542(Sigma公司，美國)、 TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國 Peprotech公司 )、兔抗人NOX4抗體，鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(SMA)、α-tubulin抗體(美國 Abcam公司)。

1.2HBx基因轉(zhuǎn)染L02細胞株 ①按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作步驟，將pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入對數(shù)生長期L02細胞，陰性對照組轉(zhuǎn)染空pcDNA3.1質(zhì)粒。②轉(zhuǎn)染48 h，細胞以1∶10比例稀釋后，重新鋪24孔板。經(jīng)適當濃度潮霉素B選擇培養(yǎng)2 w，種至96孔板。③挑取較大單克隆，消化后擴大增殖至24孔板培養(yǎng)，最終擴大至6孔板培養(yǎng)，直至可進行Western印跡實驗檢測HBx蛋白表達，建立L02-HBx細胞株。

1.3ELISA檢測L02-HBx細胞培養(yǎng)上清中TGF-β1的表達 收集L02-HBx、L02-pcDNA3.1(陰性對照組)、L02細胞株(空白對照組)24 h的培養(yǎng)基，離心，吸取上清液，嚴格按照Peprotech公司TGF-β1 ELISA試劑盒說明書操作，酶標儀450 nm波長測量各孔吸光值。

1.4制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx蛋白的肝細胞條件培養(yǎng)基 分別將三組細胞株以1×105密度接種于6孔板，待細胞培養(yǎng)至80%～90%融合度時更換為不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，48 h后吸取培養(yǎng)基，離心后取上清液即為條件培養(yǎng)基。

1.5Western印跡檢測條件培養(yǎng)基孵育的HSC中NOX4和α-SMA蛋白的表達 將LX-2細胞以1×105密度接種于6孔板，待細胞培養(yǎng)至80%～90%融合度時更換為不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，饑餓24 h。再以上述制備的L02-HBx條件培養(yǎng)基作用于饑餓后的LX-2細胞，陰性對照組為L02-pcDNA3.1條件培養(yǎng)基，空白對照組為L02條件培養(yǎng)基。處理24 h后，以含有1/100苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA細胞裂解液溶解細胞，提取蛋白，并以BCA法定量。蛋白變性、上樣，行SDS-PAGE電泳，恒壓80 V，30 min后轉(zhuǎn)恒壓120 V 90 min，蛋白轉(zhuǎn)PVDF膜，轉(zhuǎn)膜75 min，封閉1 h，洗膜后分別與封閉液稀釋的特異一抗于4℃孵育過夜，PBST洗膜30 min，二抗孵育，室溫1 h，PBST洗20 min，化學發(fā)光法顯影。實驗平行重復3次。

1.6Western印跡檢測NOX4敲減后HSC中α-SMA及NOX4蛋白表達 以NOX4 siRNA轉(zhuǎn)染 L02-HBx條件培養(yǎng)基孵育的LX-2細胞，轉(zhuǎn)染介質(zhì)為LipofectamineTM2000脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑盒，陰性對照組轉(zhuǎn)染無關siRNA序列，空白對照組不加干擾序列。轉(zhuǎn)染24 h后，提取上述3組細胞的總蛋白，進行Western印跡檢測，方法同上。實驗平行重復3次。

1.7Western印跡檢測加入TGF-β1受體抑制劑后NOX4蛋白的表達 將L02-HBx條件培養(yǎng)基分為3組，分別為：10 μmol/L SB-431542處理組，PBS處理組，未加處理組。將以上3組條件培養(yǎng)基孵育LX-2細胞24 h后，提取上述3組細胞的總蛋白，進行Western印跡檢測NOX4蛋白的表達，方法同上。實驗平行重復3次。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1肝細胞中HBx蛋白的表達 L02-HBx細胞中有相對分子質(zhì)量17 kD的條帶出現(xiàn)，而其余兩組細胞中無此條帶出現(xiàn)(圖1)，說明L02-HBx細胞可以穩(wěn)定表達HBx蛋白。

2.2L02-HBx細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的表達 L02-HBx組、陰性對照組及空白對照組細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的表達量分別為(2 913.55±579.82)、(209.40±69.36)、(230.57±55.76)pg/ml，L02-HBx細胞培養(yǎng)上清中TGF-β1的表達量顯著高于其他兩組(均P<0.01)。

2.3L02-HBx的條件培養(yǎng)基孵育HSC后，NOX4和α-SMA的蛋白表達 與L02-HBx共培養(yǎng)的LX-2細胞(LX-2/L02-HBx)中NOX4(179.98±20.96)和α-SMA蛋白(180.27±18.05)表達均顯著高于陰性對照組(105.71±13.47，89.7±14.37)和空白對照組(111.8±24.82，93.66±18.42，P<0.01)，見圖2。

2.4敲減NOX4后HSC中α-SMA蛋白的表達 LX-2/ L02-HBx+si-NOX4組中隨著NOX4表達(125.78±12.04)的下調(diào)，α-SMA的表達(121.81±33.89)也顯著低于陰性對照組(244.33±14.61，216.06±20.1)和空白對照組(242.04±25.28，221.46±27.34，P<0.05)，見圖3。

2.5在L02-HBx的條件培養(yǎng)基中加入TGF-β1受體抑制劑后NOX4蛋白的表達 加入SB-431542的L02-HBx的條件培養(yǎng)基，孵育過的LX-2中NOX4蛋白表達(53.04±9.39)顯著低于空白對照組(122.07±12.44，P<0.05)，見圖4。

1.L02-HBx;2.陰性對照組;3.空白對照組圖1 肝細胞中HBx蛋白的表達

1.LX-2/L02-HBx;2.陰性對照組;3.空白對照組圖2 不同條件培養(yǎng)基孵育后，LX-2中NOX4和α-SMA蛋白的表達

1.LX-2/L02-HBx+si-NOX4;2.陰性對照組;3.空白對照組圖3 敲減NOX4后HSC中α-SMA和NOX4蛋白的表達

1.LX-2/L02-HBx+ SB-431542;2.空白對照組圖4 L02-HBx條件培養(yǎng)基中加入SB-431542后NOX4蛋白的表達

3 討 論

HBV感染是慢性肝炎、肝硬化、肝細胞癌的重要致病因素之一，但其發(fā)病機制尚未完全闡明。HBx蛋白由HBV DNA中一個最小的開放閱讀框架編碼而成，由154個氨基酸組成，是一個多功能的調(diào)節(jié)因子。研究認為HBx蛋白在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用〔6〕，如：它可以通過調(diào)節(jié)肝癌細胞轉(zhuǎn)錄、干擾正常肝細胞修復、影響多種細胞信號通路等方式，從而調(diào)控肝癌細胞的生長、增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。HSC是肝纖維化病理過程中ECM的主要細胞來源，它的活化在肝纖維化疾病進展中發(fā)揮重要作用。目前，很多研究者致力于HBV導致肝纖維化機制的研究，結果表明〔7，8〕，HBV可以通過多種途徑啟動HSC的活化，而HBx蛋白可以促進其增殖并使其在肝纖維化的病理過程中發(fā)揮作用，但HBx活化HSC的具體機制尚未完全闡明。以往研究顯示〔9，10〕，NOX4在肝纖維化的大鼠模型中表達增加，尤其在HSC中的表達顯著高于對照。Lan等〔5〕揭示NOX4通過介導多條細胞信號通路，誘導HSC的持續(xù)激活。但NOX4在乙肝相關的肝纖維化中是否對HSC的活化發(fā)揮重要作用尚未有文獻報道。TGF-β1是公認的最強致纖維化的細胞因子，它誘導發(fā)生肝纖維化的主要機制有：促進ECM的合成及抑制其降解、直接激活HSC、誘導肝細胞通過EMT轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞等〔11〕。但TGF-β1在乙肝相關的肝纖維化中是否調(diào)節(jié)NOX4的表達，進而影響HSC的活化尚需進一步實驗證實。為了更好地模擬人感染HBV后，肝細胞與HSC所發(fā)生的病理生理過程，本課題的研究對象區(qū)別于以往國內(nèi)外所使用的HepG2、 SMMC-7721等肝癌細胞株，以具有正常肝細胞形態(tài)功能的L02肝細胞株及人正常HSC株LX-2為研究對象，結果顯示L02-HBx細胞條件培養(yǎng)基孵育的LX-2細胞中，α-SMA和NOX4的蛋白表達明顯增高，TGF-β1在L02-HBx細胞條件培養(yǎng)基中的表達量也明顯增高。因此課題組做出如下假設：表達了HBx蛋白的肝細胞可以通過旁分泌TGF-β1的方式上調(diào)NOX4，NOX4進一步促進HSC的活化，從而促進肝纖維化的發(fā)生。

本研究利用si-NOX4干擾了L02-HBx條件培養(yǎng)基孵育的LX-2細胞后，檢測其表達及活化情況，結果表明隨著NOX4蛋白表達的下調(diào)，HSC活化標志物α-SMA的表達也部分地下調(diào)，這表明在乙肝相關的肝纖維化中，NOX4與α-SMA的表達具有一定的相關性，NOX4在HSC的活化中發(fā)揮了一定作用，在L02-HBx細胞條件培養(yǎng)基中加入TGF-β1的受體阻斷劑后，細胞中NOX4的表達顯著降低。本研究屬體外實驗，故而其結論有待進一步的動物實驗進一步加以驗證。

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