隋韶光 甘 露 崔 明 王翠翠 楊初蔚 李向東

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診科，遼寧 大連 116033)

有報(bào)道顯示〔1〕，我國每年約有100萬人死于膿毒血癥，且患者多以白色假絲酵母菌感染為主。目前，臨床上對(duì)于膿毒血癥發(fā)病機(jī)制尚不完全知曉，且多以動(dòng)物模型為主，但是一直未找到合適的動(dòng)物模型制備方法。研究顯示〔2〕，P38MAPK和人源葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)4蛋白在膿毒血癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，但是該結(jié)論尚未得到進(jìn)一步證實(shí)。本研究旨在探討膿毒血癥大鼠模型建立方法及其對(duì)P38MAPK和GLUT4轉(zhuǎn)位通路的影響。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及器材 新生大鼠26只作為觀察組，SPF級(jí)，雌雄隨機(jī)，體重200～250 g，平均(230±18)g。取同期入組健康新生大鼠26只作為對(duì)照組，SPF級(jí)，雌雄隨機(jī)，體重203～252 g，平均(231±20)g。動(dòng)物均由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)大鼠飼養(yǎng)、處理均符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)下意見》〔3〕相關(guān)規(guī)則。實(shí)驗(yàn)均通過大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)同意。主要儀器和試劑主要有兔抗鼠 GLUT4 抗體(美國 Bioworlde 公司)、Western 細(xì)胞裂解液(碧云天生物公司)、兔抗鼠β-actin 抗體(北京中杉公司)、倒置顯微鏡(德國 LEICA 公司)、TGL-18R 冷凍高速離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)、超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)、手術(shù)器械一套(上海第六人民醫(yī)院)。

1.2膿毒血癥大鼠模型建立 觀察組采用白色假絲酵母菌感染法建立膿毒血癥大鼠模型：取對(duì)數(shù)生長期的白色假絲酵母菌，濃度控制在4×108集落形成/L。根據(jù)大鼠體重尾靜脈注射1 ml/kg假絲酵母菌液，形成膿毒血癥大鼠模型。對(duì)照組給予尾靜脈注射1 ml/kg生理鹽水。在6、12、24、36 h時(shí)觀察兩組大鼠形態(tài)，麻醉后心臟取血，離心5 min，速度1 000 r/min，取上清保存在-80℃待檢。處死大鼠后取其心、肝、腎等組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)3次沖洗后放入甲醛溶液中保存，行HE染色〔4〕。

1.3P38MAPK和GLUT4蛋白水平測定 采用Western印跡方法測定P38MAPK和GLUT4蛋白表達(dá)水平。取兩組組織，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，采用PBS沖洗3次，將培養(yǎng)瓶放置在冰上，按每1 ml裂解液加入10 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)原則加入裂解液，使得細(xì)胞充分裂解，然后將細(xì)胞放置在培養(yǎng)瓶一側(cè)，1 200 r/min離心5 min，取上清液，放置在-20℃離心管中。配置8%的分離膠，加入四甲基乙二胺(TEMED)后搖晃，并將其放置在玻璃凝膠夾板中〔5〕。利用BCA檢測兩組細(xì)胞蛋白上樣量，以第一孔高分子量預(yù)染Marker作為對(duì)比，對(duì)于預(yù)染Marker藍(lán)帶進(jìn)入分離膠1～1.5 cm時(shí)停止電泳，轉(zhuǎn)膜后加入一抗孵育、二抗孵育，利用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法完成顯影、定影及曝光等步驟，取出膠片后采用生理鹽水進(jìn)行沖洗，并采用雙蒸水搖晃洗滌硝酸纖維素膜，漂洗1 h，封閉后利用凝膠圖像處理系統(tǒng)測定P38MAPK和GLUT4蛋白水平及β-actin灰度值的比值作為相對(duì)表達(dá)量〔6〕。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件行χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組大體情況比較 對(duì)照組注射生理鹽水后均存活，大鼠未見明顯異常。觀察組建立膿毒血癥模型后出現(xiàn)不同程度中毒癥狀，處于嗜睡狀態(tài)，飲食差。部分大鼠出現(xiàn)蜷縮，對(duì)刺激性反應(yīng)明顯減弱。

2.2兩組心、肝、腎組織HE染色 觀察組心、肝、腎組織均出現(xiàn)不同程度的炎癥，組織中存在輕微腫脹及白細(xì)胞浸潤；對(duì)照組大鼠組織無變化。見圖1。

圖1 觀察組與對(duì)照組心、肝、腎組織HE染色(×200)

2.3兩組P38MAPK和GLUT4蛋白表達(dá)水平比較 兩組β-actin灰度值水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組P38MAPK和GLUT4蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1，圖2。

表1 兩組P38MAPK和GLUT4蛋白表達(dá)水平比較

圖2 兩組P38MAPK和GLUT4蛋白表達(dá)水平

3 討 論

報(bào)道顯示〔7〕，全球每年約有1 800多萬人死于膿毒血癥，并以1.5%的增長率增長。我國屬于膿毒血癥發(fā)病率較高的國家，發(fā)病率8.68%，患者發(fā)病后臨床癥狀缺乏特異性，多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)。膿毒血癥發(fā)病機(jī)制涉及腎臟血流動(dòng)力學(xué)、內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)損傷等。

P38MAPK屬于MAPK中相對(duì)比較重要的家庭成員之一，P38MAPK不僅能在機(jī)體中發(fā)揮良好的脂肪酸氧化功效，并且能調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)。在多種刺激下，P38MAPK中的蘇氨酸及酪氨酸殘基能發(fā)生雙磷酸化，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)〔8〕。同時(shí)，P38MAPK與細(xì)胞表面的GLUT4蛋白活化水平有關(guān)，GLUT4蛋白主要分布在人體骨骼肌中，屬于是一種運(yùn)輸載體，對(duì)于膿毒血癥大鼠建模成功后會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生一系列及聯(lián)效應(yīng)，導(dǎo)致GLUT4蛋白轉(zhuǎn)位到細(xì)胞外膜中，提高了機(jī)體內(nèi)的活性，從而促進(jìn)疾病的發(fā)生、發(fā)展〔9〕。本研究提示測定P38MAPK和GLUT4蛋白表達(dá)能了解膿毒血癥大鼠病情變化，根據(jù)測定結(jié)果制定相應(yīng)的治療方案〔10,11〕。

4 參考文獻(xiàn)

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