劉 拴 張明勇 胡 冰

(武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430064)

1 材料與方法

1.1實驗動物 48只3月齡健康新西蘭白兔，雌雄各半，購自南京模式動物研究所。

1.2試劑與材料 注射用鹽酸氯胺酮(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司)；鹽酸異丙嗪注射液(成都倍特藥業(yè)有限公司)；鹽酸利多卡因注射液(山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責任公司)；免疫組化SP試劑盒(中國醫(yī)學科學院生物工程研究所)；Ⅱ型膠原一抗(上海美迪西生物醫(yī)藥有限公司)；胎牛血清(北京生物制品研究所)；注射用青霉素鈉(桂林南藥股份有限公司)；乙二胺四乙酸、多聚甲醛、DMEM以及胰蛋白酶均購自美國Sigma公司。脫細胞軟骨支架材料為本實驗室自行制成，經(jīng)常規(guī)消毒等處理后保存于干燥環(huán)境中。

1.3儀器設(shè)備 手術(shù)各操作器械、實驗臺等由本實驗室提供；二氧化碳培養(yǎng)箱(Hcracus公司)；相差倒置顯微鏡(德國AFM公司)；組織包埋機及切片機(泰維科技有限公司)；顯微攝影成像系統(tǒng)(徠卡公司)；數(shù)碼相機(德國萊次公司)。

1.4實驗方法

1.4.1組織工程軟骨的制作 采用密度梯度離心和差速貼壁法獲得原代兔BMSC，在培養(yǎng)期間，進行光鏡觀察2次。當細胞間隙變大，出現(xiàn)漩渦狀孔隙時添加等體積FBS將胰酶中和，吸出細胞液后將瓶壁上細胞層反復沖洗，制成單細胞懸液。吸取懸液15 ml，離心3 min，棄上清，加入DMEM液重懸單細胞懸液，經(jīng)細胞計數(shù)板計數(shù)。取豬膝關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)清洗、冷凍和干燥處理后分為骨粉末，使用胰酶消化和清洗，消毒后待用。取無菌ACM手工切成4 mm×4 mm×3 mm體積大顆粒，分別放入6孔板中，將稀釋至1×106個/ml的BMSC單細胞懸液，滴加至6孔板中，37℃、5%二氧化碳飽和濕度條件下孵育2 h。

1.4.2膝關(guān)節(jié)軟骨缺損動物模型的制作和修復 48只新西蘭白兔，隨機分為3組，ACM-BMSC組，ACM組，空白對照組。各個組再分為6 w和12 w時間點。將新西蘭白兔稱重后，記錄重量，根據(jù)重量，注射鹽酸氯胺酮2 ml/kg，每只新西蘭白兔注射一支鹽酸異丙嗪，注射方式為臂肌注射；對于膝關(guān)節(jié)區(qū)目標手術(shù)部位先脫毛后再牢固固定，常規(guī)消毒之后給予1%利多卡因麻。于兔膝關(guān)節(jié)前內(nèi)側(cè)入路，暴露膝關(guān)節(jié)，屈曲膝關(guān)節(jié)，充分暴露股骨內(nèi)側(cè)踝。制造軟骨缺損3 mm深，達軟骨下骨且能夠感覺到有突破感、孔內(nèi)滲血。將組織工程化骨植入缺損部位并壓滿。伸直術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)后復位髕骨，縫合切口。術(shù)后追加使用抗生素，青霉素80萬U/d。新西蘭白兔分開飼養(yǎng)，自由活動。

1.5主要觀察指標 6 w、12 w時分別處死8只新西蘭白兔，取出膝關(guān)節(jié)標本仔細觀察。將動物標本常規(guī)使用4%多聚甲醛固定后使用EDTA脫鈣3個月，常規(guī)制備石蠟切片，經(jīng)HE染色和免疫組化染色后在光鏡下觀察。同時進行Wakitani組織學評分。Wakitani組織學評分：分為細胞形態(tài)、基質(zhì)染色、表面平整、軟骨厚度、接合、總分。細胞形態(tài)，全部為透明軟骨為0分，大多數(shù)為透明軟骨為1分，主要是纖維軟骨為2分，大多數(shù)不是透明軟骨為3分，無透明軟骨為4分。基質(zhì)染色，正常為0分，略有減少為1分，顯著減少為2分，其他為3分。表面平整，平整超過3/4為0分，居中(1/2～3/4)為1分，不規(guī)則為2分，非常不規(guī)則為3分。軟骨厚度大于2/3為0分，1/3～2/3為1分，不足1/3為2分。接合，接合較好為0分，只有1邊接合為1分，均不接合為2分?？偡郑簼M分14分，分值越低，軟骨缺損修復越好。

其中：被解釋變量Lapro為勞動生產(chǎn)率。解釋變量Time為時間虛擬變量，表示最低工資標準實施前后，實施前為0，實施后為1。解釋變量Treat表示是否落實最低工資標準的虛擬變量，落實為1，未落實為0。Time×Treat表示解釋變量Time和Treat的乘積，系數(shù)β3表示最低工資標準對于企業(yè)勞動生產(chǎn)率的影響。控制變量X表示影響企業(yè)勞動生產(chǎn)率的其他因素，包括企業(yè)特征和所在地區(qū)經(jīng)濟發(fā)展水平。

1.6統(tǒng)計學分析 應用SPSS17.0軟件進行秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1實驗動物大致觀察分析 三組實驗動物關(guān)節(jié)腔沒有看到感染積液，沒有發(fā)生關(guān)節(jié)腔粘連情況。術(shù)后6 w：ACM-BMSC組，與附近正常組織新生軟骨完全填充，表面基本接合，表面光滑、乳白色；ACM組新生軟骨不完全填充，與附近正常組織有所接合，表面不光滑、偏白色；空白對照組新生軟骨填充很少，與附近正常組織不接合，表面裂隙較多、偏白色；術(shù)后12 w：ACM-BMSC組完全修復，與附近正常組織完全接合，表面光滑、乳白色；ACM組不完全修復，與附近正常組織接合處仍有裂隙，表面不光滑、偏白色；空白對照組修復較少，與附近正常組織不接合，表面裂隙較多、偏白色。術(shù)后6 w和12 w關(guān)節(jié)缺損部位直接觀察結(jié)果見圖1。

圖1 關(guān)節(jié)缺損部位觀察

2.2術(shù)后關(guān)節(jié)組織學觀察 術(shù)后6 w ACM-BMSC組修復組織與周圍組織接合良好，表層可見梭形成纖維細胞，縱軸與表面平行，修復細胞呈圓形透明軟骨樣細胞，基質(zhì)染色與周圍正常軟骨基質(zhì)比較有所下降，潮線清晰。ACM組修復組織與周圍組織有所接合，表層細胞層次排列紊亂，深層可見成纖維樣細胞修復，細胞深層可見透明軟骨樣細胞，基質(zhì)染色與周圍正常軟骨基質(zhì)比較明顯下降，潮線無?？瞻讓φ战M無明顯類軟骨組織修復，僅有少量類肉芽組織。術(shù)后12 w ACM-BMSC組修復組織與周圍組織接合良好，表層可見梭形成纖維細胞，縱軸與表面平行，修復細胞呈圓形透明軟骨樣細胞，基質(zhì)染色與天然軟骨組織接近，潮線清晰。ACM組修復組織與周圍組織有所接合，表層細胞層次排列紊亂，深層可見成纖維樣細胞，修復細胞深層可見透明軟骨樣細胞，基質(zhì)染色與周圍正常軟骨基質(zhì)比較明顯下降，潮線無?？瞻讓φ战M無明顯類軟骨組織修復，僅有少量類肉芽組織。見圖2。

2.3Wakitani組織學評分比較 在同一時間段內(nèi)，不同組間細胞形態(tài)、基質(zhì)染色、表面平整、軟骨厚度、接合、總分比較，ACM-BMSC組和空白對照組、ACM組和空白對照組比較，差異顯著(P<0.05)；ACM-BMSC組和ACM組比較無差異顯著(P>0.05)。見表1。

圖2 術(shù)后關(guān)節(jié)組織學觀察(HE，×100)

時間組別細胞形態(tài)基質(zhì)染色表面平整軟骨厚度接合總分6 wACM-BMSC組1.49±0.441)1.39±0.461)0.79±0.661)0.59±0.611)0.79±0.641)4.99±1.221)ACM組1.79±0.471)1.59±0.481)0.89±0.571)0.59±0.481)0.88±0.541)5.79±0.881)空白對照組2.49±0.331.58±0.471.88±0.540.88±0.571.79±0.468.59±1.2212 wACM-BMSC組1.29±0.481)0.99±0.411)0.88±0.471)0.49±0.491)0.77±0.411)4.43±1.441)ACM組1.49±0.471)1.38±0.441)0.79±0.411)0.59±0.481)0.88±0.541)5.09±1.551)空白對照組2.29±0.441.49±0.371.99±0.751.09±0.331.49±0.378.39±1.11

與空白對照組比較：1)P<0.05

3 討 論

組織工程學作為一門以細胞生物學與材料學核心內(nèi)容的新興學科，其主要通過重新構(gòu)建組織器官修復和改善疾病，主要分為種子細胞、生物材料和體內(nèi)微環(huán)境等內(nèi)容〔4～7〕。目前，軟骨細胞、充質(zhì)干細胞是臨床上主要使用的細胞類型。在大量人體和動物試驗中均有實踐證明，國內(nèi)的多項研究也證實自體軟骨細胞在其中有更好的軟骨成骨效果〔8～10〕。而異體軟骨細胞雖然能夠通過包裹基質(zhì)被植入，但卻容易遭到自然殺傷細胞的攻擊。有研究指出，若采用同種異體軟骨細胞復合的支架材料進行關(guān)節(jié)軟骨修復，有確切效果，在一定程度上豐富了種子細胞的來源〔11，12〕。間充質(zhì)干細胞具備多種分化的潛能，且若應用BMSC不僅取材來源與操作方便，對供體也不會產(chǎn)生明顯影響，分離培養(yǎng)十分方便，體外增殖能力也十分理想，來源也不受限制〔13〕。

目前，組織工程中支架材料主要包括兩種，一種是天然生物可降解材料，另一種是人工合成生物可降解材料〔14,15〕。組織工程支架材料需要有良好的生物相容性和降解性，具備三維多孔立體結(jié)構(gòu)，要有一定的機械強度。在軟骨組織工程中，支架材料則應該有足夠的孔隙結(jié)構(gòu)，促進細胞黏附和增殖，可以通過表面修飾等，對細胞的黏附和生長進行調(diào)控〔16〕。還需要具備一定的彈性，支架還需要能夠和周圍的組織融為一體，不容易缺損和脫落。當然，這些都是理想狀態(tài)的要求，至今尚未發(fā)現(xiàn)存在。

本文所獲得的BMSC作為種子細胞，生長良好，純度較高。生物材料方面，細胞外基質(zhì)(ECM)作為軟骨支架材料中的重要部分，具備連接、支持等作用。通過處理后，ACM最大程度保留了細胞賴以生存的細胞外基質(zhì)，與生物天然軟骨基質(zhì)成分十分接近，適合細胞生存。近幾年，細胞和支架的接種技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床上已經(jīng)出現(xiàn)了沉淀法、浸漬法、吸附法等多種技術(shù)。本文結(jié)果顯示脫細胞軟骨支架材料在解剖和組織結(jié)構(gòu)上均基本達到了本研究預期的修復目標，但其修復細胞的排列方式和正常軟骨細胞依然存在一定的區(qū)別。研究更為完美的修復方法有著更為重要的實踐價值。

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