李三華 陳全利 楊加強(qiáng)

(遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563099)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)主要原因是絕經(jīng)后卵巢合成的雌激素減少，進(jìn)而導(dǎo)致的內(nèi)分泌紊亂造成骨吸收增多而使骨形成和骨吸收的平衡被打破。杜仲具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功效。前期試驗發(fā)現(xiàn)杜仲總黃酮(TFE)在體外具有促進(jìn)大鼠成骨樣細(xì)胞增殖和護(hù)骨素mRNA表達(dá)等作用〔1～3〕。本文擬分析TFE對去卵巢大鼠骨組織代謝的影響。

1 材料與方法

1.1材料 6月齡SD雌性大鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心，杜仲購自遵義市中藥材市場；戊酸雌二醇(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；大鼠Ⅰ型前膠原氨基端肽(PINP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒和β-Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(β-CTXⅠ)ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；體視顯微鏡(德國LEICA，M125)；小動物雙能X射線骨密度儀(美國Faxitron，DHX)。

1.2TFE的提取 杜仲樹皮粉碎成粉末后過60目篩，精密稱重1 kg，加入60%乙醇1.2 L，在微波功率200 W條件下加熱提取20 min，過濾，提取2次，合并濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后烘干至恒重得到杜仲皮提取物；再經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化，采用70%乙醇洗脫、富集、濃縮干燥得到TFE 38 g，總黃酮用無菌雙蒸水配制成混懸液備用。

1.3骨質(zhì)疏松大鼠模型的制作 6月齡雌性SD大鼠36只，隨機(jī)選取30只按30 mg/kg 的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺，常規(guī)消毒備皮后于腹腔下部正中切開約1 cm長切口，找出雙側(cè)卵巢并摘除，術(shù)畢傷口內(nèi)注射硫酸慶大霉素1萬U，縫合肌肉皮膚并常規(guī)消毒。余下6只切開腹腔不摘除卵巢并縫合腹腔作為假手術(shù)組。

1.4動物分組及處理 去卵巢手術(shù)1 w后，30只去卵巢大鼠隨機(jī)平均分為模型組、TFE低、中、高劑量組和雌二醇組，假手術(shù)組和模型組只自由進(jìn)食飲水；TFE低、中、高劑量組在自由進(jìn)食飲水的基礎(chǔ)上，分別灌胃50、100、200 mg·kg-1·d-1TFE，持續(xù)5 d/w；雌二醇組在自由進(jìn)食飲水的基礎(chǔ)上，每周灌胃2次戊酸雌二醇，每次1.5 mg/kg體重。實驗處理持續(xù)12 w。

1.5觀察指標(biāo) 實驗結(jié)束后麻醉處死大鼠，腹主動脈取血，室溫?zé)o菌靜置凝固1 h,2 000 r/min離心10 min收集血清，按ELISA試劑盒說明書測定血清PINP和β-CTXⅠ的濃度；取右側(cè)股骨于小動物雙能X射線骨密度儀上測量骨密度和骨礦物質(zhì)含量；取右側(cè)脛骨經(jīng)不脫鈣切片后進(jìn)行VanGieson染色于顯微鏡下觀察骨膠原的表達(dá)，測量粉紅色染色區(qū)域面積在骨組織中的面積比(骨膠原面積比)。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TFE對去卵巢大鼠血清指標(biāo)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組PINP和β-CTXⅠ水平均顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，TFE中、高劑量組PINP濃度顯著升高(P<0.05)，TFE中、高劑量組及雌二醇組β-CTXⅠ濃度顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2TFE對去卵巢大鼠骨組織的影響 與假手術(shù)組比較,模型組、TFE低、中、高劑量組和雌二醇組股骨骨密度、骨礦物質(zhì)含量和脛骨骨膠原面積均明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，TFE中、高劑量組骨密度和骨膠原面積比顯著回升(P<0.05)；TFE各組骨礦物質(zhì)含量均顯著增加(P<0.05)。模型組和TFE低劑量組骨膠原比較稀疏，TFE中、高劑量組和雌二醇組骨膠原增多，分布較為密集，見表1，圖1。

表1 各組血清和骨組織指標(biāo)比較

1)與假手術(shù)組比較，2)與雌二醇組比較，3)與TEF高劑量組比較，4)與TEF中劑量組比較，5)與TEF低劑量組比較：均P<0.05

圖1 各組骨膠原VanGieson染色(標(biāo)尺長度2 mm)

3 討 論

雌激素在骨生長、礦化和細(xì)胞的分化及功能活性中發(fā)揮重要作用；隨著年齡的增加，女性雌激素水平下降，成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性逐漸下降，而破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致骨高轉(zhuǎn)換且骨吸收活動強(qiáng)于骨形成，因而骨密度降低，骨的顯微結(jié)構(gòu)退變和骨質(zhì)丟失，進(jìn)而導(dǎo)致骨的脆性增加，骨折風(fēng)險增高。雌激素降低是導(dǎo)致絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松的重要原因，對于PMOP的治療，臨床上多以補(bǔ)充外源性雌激素的方法即傳統(tǒng)的雌激素替代治療和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)為主要方法,但都有一定的副作用，增加卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等疾病的風(fēng)險〔4，5〕。黃酮類物質(zhì)是植物雌激素的一種，廣泛存在于蔬菜、水果和藥用植物等中。杜仲中的黃酮類物質(zhì)主要包含槲皮素、山奈酚、紫云英苷和蘆丁〔6，7〕，筆者前期實驗提示TFE可能具有防治骨質(zhì)疏松的功效〔1～3〕。

骨是持續(xù)進(jìn)行骨重建的動態(tài)器官，骨重建過程包括成骨細(xì)胞成骨和破骨細(xì)胞溶骨；PINP 和β-CTX能夠快速且靈敏地反映骨形成和骨吸收的狀態(tài)，動態(tài)反映機(jī)體內(nèi)骨重建的狀況〔8〕。骨密度是指骨礦物質(zhì)密度，反映骨形成和骨吸收的平衡狀態(tài)，骨密度檢測是預(yù)測絕經(jīng)后骨丟失的靈敏指標(biāo)之一，是判定骨質(zhì)疏松的“金標(biāo)準(zhǔn)”〔9〕。骨膠原是骨有機(jī)質(zhì)的主要成分，不僅為骨的礦化提供基本場所，還與骨細(xì)胞的發(fā)育、生長和活性調(diào)節(jié)有關(guān)，其含量、結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性直接影響骨微結(jié)構(gòu)和骨生力學(xué)特性,對維持骨的質(zhì)量有重要作用。本實驗揭示了雌激素缺乏的大鼠其骨形成和骨吸收都在增強(qiáng)的骨高轉(zhuǎn)換特點；且雌激素缺乏后骨的吸收活動強(qiáng)于骨形成；TFE可能抑制了骨吸收同時也促進(jìn)了骨的形成。本文結(jié)果表明TFE對雌激素缺乏SD大鼠的骨組織具有保護(hù)作用。

4 參考文獻(xiàn)

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