郭亞春 趙曉菲 黃 群 李 衛(wèi) 尹 靜 白 冰 宋鴻儒

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

輔助性T細(xì)胞(Th)1與Th2細(xì)胞是一對(duì)相互制約的免疫細(xì)胞，主要通過分泌細(xì)胞因子參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，Th1與Th2細(xì)胞及其分泌因子的平衡對(duì)于機(jī)體的免疫微環(huán)境的穩(wěn)定十分重要，一旦這種平衡關(guān)系被打破，可引發(fā)機(jī)體多種疾病的發(fā)生。研究表明，Th1與Th2失衡可能參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的發(fā)病，調(diào)節(jié)Th1與Th2平衡成為目前研究RA治療的焦點(diǎn)〔1〕。薯蕷皂苷元是穿龍薯蕷在機(jī)體內(nèi)的代謝吸收產(chǎn)物，穿龍薯蕷具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等作用〔2〕。中藥穿山龍具有祛風(fēng)除濕、舒筋活血、活血止痛等功效，臨床用于治療骨刺、骨性關(guān)節(jié)病、心血管疾病等。前期研究表明，穿山龍?zhí)崛∥锸硎氃碥赵獙?duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠灌胃治療可以調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞〔3〕。本研究擬探討薯蕷皂苷元對(duì)Th1與Th2細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制，為穿龍薯蕷的開發(fā)應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 DBA/J小鼠，雄性，75只，7～8周齡，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002，SPF級(jí)動(dòng)物室常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫冰箱，美國Thermo公司；ScanSpeed 1580R離心機(jī)，丹麥Labogene公司；細(xì)胞操作超凈臺(tái)，美國ESCO公司；InnoScan 300 Microarray Scanner熒光掃描儀，Innopsys公司，Wellwash Versa芯片洗板機(jī)，Thermo公司；QAM-TH17-1試劑盒，Ray biotech公司；穿龍薯蕷皂苷元，中國南京春秋生物工程有限公司，純度>98%；細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)(CCK-8)試劑盒，日本同仁化學(xué)公司；雞Ⅱ型膠原，Chondrex公司；弗式完全佐劑，Sigma公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基，Gibco公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1CIA模型建立及淋巴細(xì)胞分離 制備CIA模型參照文獻(xiàn)〔4〕，常規(guī)處死CIA模型鼠，浸泡于75%酒精中消毒5 min，超凈臺(tái)中無菌取出腹股溝淋巴結(jié)，200目濾網(wǎng)研磨制備淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，0.4%臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)并調(diào)細(xì)胞濃度。

1.3.2CCK-8檢測(cè)藥物毒性 調(diào)整T淋巴細(xì)胞終濃度為2×106/ml，設(shè)空白組(單純的1640完全培養(yǎng)基)、對(duì)照組(細(xì)胞懸液未加藥物)、藥物組(終濃度分別為3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μmol/L)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為200 μl，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，于44 h時(shí)，每孔加入20 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出培養(yǎng)板用酶標(biāo)儀檢測(cè)(450 nm,中速，30 s)OD值(A值)，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率，選擇存活率在70%以上的藥物濃度。細(xì)胞存活率=〔(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)〕×100%。

1.3.3CCK-8法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖 分離好的淋巴細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞終濃度為2×106/ml，分為空白組(單純的1640完全培養(yǎng)基)、對(duì)照組(細(xì)胞懸液未加藥物)、藥物組(薯蕷皂苷元終濃度分別為3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μmol/L)，種入96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔雞Ⅱ型膠原終濃度50 μg/ml、IL-2終濃度100 U/ml作為刺激劑，每孔終體積200 μl，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，于培養(yǎng)44 h時(shí)，每孔加入20 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，450 nm處酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔OD值，計(jì)算各組細(xì)胞抑制率。

1.3.4實(shí)驗(yàn)分組 CIA模型鼠淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液分為空白組(淋巴細(xì)胞加入IL-2刺激)、細(xì)胞模型組(淋巴細(xì)胞加入IL-2和膠原刺激)、薯蕷皂苷元高劑量組(淋巴細(xì)胞加入IL-2和膠原刺激及高劑量薯蕷皂苷元)、中劑量組(淋巴細(xì)胞加入IL-2和膠原刺激及中劑量薯蕷皂苷元)、低劑量組(淋巴細(xì)胞加入IL-2和膠原刺激及低劑量薯蕷皂苷元)，IL-2和膠原的終濃度分別為100 U/ml和50 μg/ml。

1.3.5基因芯片法檢測(cè)各組細(xì)胞因子表達(dá)水平 參照試劑盒將玻片芯片在室溫平衡20～30 min后，將芯片放在真空干燥器干燥1～2 h。按試劑盒說明對(duì)細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋。然后添加100 μl的標(biāo)準(zhǔn)液和樣品到孔中，4℃過夜孵育。用1倍洗液Ⅰ進(jìn)行清洗，每孔250 μl的1倍洗液Ⅰ，清洗10次，每次震蕩10 s。然后換用1倍洗液Ⅱ通道進(jìn)行清洗，每孔250 μl的1倍洗液Ⅱ，清洗6次，每次震蕩10 s。離心檢測(cè)抗體混合物小管，加入1.4 ml的樣品稀釋液混合均勻，添加80 μl的檢測(cè)抗體到每個(gè)孔中，搖床孵育1.5 h，清洗同上。離心Cy3-鏈霉親和素小管，加入1.4 ml的樣品稀釋液混合均勻，添加80 μl的Cy3-鏈霉親和素到每個(gè)孔中，用鋁箔紙包住玻片避光，搖床上孵育1 h，清洗同上。采用激光掃描儀InnoScan 300掃描信號(hào)，Cy3/綠色通道(激發(fā)頻率=532 nm)。應(yīng)用QAM-TH17-1數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1小鼠的成模情況 模型鼠的背部及尾根部形成多處潰瘍，毛色暗淡干枯，進(jìn)食減少，體重下降。初次免疫28 d，后足足爪出現(xiàn)紅腫、運(yùn)動(dòng)受限。見圖1。

圖1 小鼠足爪腫脹度，右為正常鼠，左為模型鼠

2.2CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)淋巴細(xì)胞的毒性情況 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，3.125～25.000 μmol/L藥物組的存活率均在70%以上，說明3.125～25.000 μmol/L的薯蕷皂苷元對(duì)T淋巴細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性作用。見表1。

2.3CCK-8法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況 各組小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，藥物組與對(duì)照組相比，出現(xiàn)一定抑制作用，3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μmol/L藥物組抑制率分別為0.083、0.215、0.498、0.722、0.905。根據(jù)抑制率，選擇藥物的3個(gè)劑量組分別為6.250、12.500、25.000 μmol/L。

表1 薯蕷皂苷元對(duì)淋巴細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與對(duì)照組比較:1)P<0.05

2.4各組細(xì)胞因子γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-5水平比較 與空白組相比，細(xì)胞模型組IFN-γ表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，經(jīng)薯蕷皂苷元作用后IFN-γ表達(dá)水平有降低趨勢(shì)，其中高劑量組對(duì)IFN-γ表達(dá)有顯著的抑制作用(P<0.01)。細(xì)胞模型組TNF-α水平顯著升高，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，經(jīng)薯蕷皂苷元作用后TNF-α有降低趨勢(shì)，但與細(xì)胞模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白組比較，細(xì)胞模型組IL-4水平明顯上升(P<0.05)，經(jīng)薯蕷皂苷元作用后IL-4水平有上升趨勢(shì)，其中中、高劑量薯蕷皂苷元可以顯著提高IL-4的水平(P<0.05)。與空白組比較，細(xì)胞模型組IL-5水平明顯下降(P<0.01)，經(jīng)低、中、高劑量薯蕷皂苷元作用后可以顯著提高IL-5水平(P<0.01，P<0.05)。見表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5水平比較

與空白組比較：1)P<0.05；2)P<0.01；與細(xì)胞模型組比較：3)P<0.05；4)P<0.01

3 討 論

大量的炎性細(xì)胞因子參與RA關(guān)節(jié)損傷的病理進(jìn)程。在眾多的炎性細(xì)胞因子中TNF-α發(fā)揮至關(guān)重要的作用，可以作用于滑膜及軟骨細(xì)胞促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶及前列腺素等活性物質(zhì)釋放，引起關(guān)節(jié)腫脹、疼痛及關(guān)節(jié)組織的溶解破壞。TNF-α還可以介導(dǎo)破骨細(xì)胞的激活及自噬作用，引起關(guān)節(jié)軟骨及骨組織的侵蝕〔5〕。檢測(cè)活動(dòng)期RA患者體內(nèi)TNF-α發(fā)現(xiàn)，TNF-α對(duì)早期評(píng)估RA活動(dòng)度密切相關(guān)，并與IL -17等炎癥因子存在明顯的正相關(guān)〔6〕。研究顯示TNF-α還可以通過改變Foxp3表型抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能進(jìn)而加重RA患者的病情〔7〕。抑制滑膜組織及血清中的TNF-α對(duì)RA的病情具有緩解作用〔8〕。IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，可以促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1分化，抑制Th2細(xì)胞的分化及活化。在RA大鼠模型中，IFN-γ可以促進(jìn)Th1/Th2 及其細(xì)胞因子向Th1方向偏移〔9〕。IFN-γ還可以作用于自然殺傷(NK)細(xì)胞，分泌高水平的IFN-γ，誘導(dǎo)B細(xì)胞的活化，促進(jìn)樹突細(xì)胞(DC)成熟，加劇RA的炎癥反應(yīng)〔10〕。還有文獻(xiàn)顯示，IFN-γ通過抑制核因子κB受體活化因子配基(RANKL)，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的平衡，在骨形成的過程中具有負(fù)向抑制作用，加劇關(guān)節(jié)炎癥及骨破壞〔11〕。Th2細(xì)胞的分化由初始的CD4+T淋巴細(xì)胞通過T細(xì)胞抗原受體(TCR)、IL-4R信號(hào)途徑啟動(dòng)，主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子。IL-4通過Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(GATA)3的活化促進(jìn)Th2細(xì)胞擴(kuò)增，進(jìn)而抑制Th1細(xì)胞分化及TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，發(fā)揮抗炎作用。在RA的發(fā)病過程中，IL-4、IL-5等細(xì)胞因子的分泌可以改善RA的慢性關(guān)節(jié)炎癥及骨、軟骨的破壞。研究顯示IL-4可以通過抑制Smad3對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β受體的影響進(jìn)而抑制Th17細(xì)胞的分化，起到抗RA炎癥進(jìn)展的作用〔12〕。T淋巴細(xì)胞在體外一般處于靜息狀態(tài)，無法增殖，本研究在體外加入了IL-2及Ⅱ型膠原作為刺激劑，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的增殖，建立CIA體外細(xì)胞模型。研究顯示Ⅱ型膠原在體外能夠刺激CIA模型的T淋巴細(xì)胞增殖，IL-2是體內(nèi)重要的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，兩者體外聯(lián)合刺激可以有效活化CIA鼠T淋巴細(xì)胞〔13〕。

本研究說明IFN-γ、TNF-α參與了RA的發(fā)病。薯蕷皂苷元作用后，可以抑制IFN-γ及TNF-α的分泌，說明薯蕷在體內(nèi)可能通過其代謝產(chǎn)物薯蕷皂苷元對(duì)Th1 型細(xì)胞因子產(chǎn)生抑制作用，對(duì)RA的病情緩解產(chǎn)生有益的作用。IL-2及Ⅱ型膠原刺激CIA鼠T淋巴細(xì)胞后IL-4水平顯著升高，而IL-5水平顯著下降，說明可能是在特異性抗原的作用下Th2型細(xì)胞因子一過性反應(yīng)增高，經(jīng)薯蕷皂苷元作用后，IL-4、IL-5水平明顯上升進(jìn)而拮抗IFN-γ、TNF-α升高，發(fā)揮抗炎作用。

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