常曉茜 李亞萍 王君明 蔡 泓 陳榮幸 趙恒利 崔 瑛

(河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

黃連為毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch.)、三角葉黃連(C.deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云連(C.teetaWall.)的干燥根莖，藥性苦寒，歸心經(jīng)，具有清心解郁除煩之功。黃連及其復(fù)方如左金丸、黃連阿膠湯等對(duì)抑郁癥或焦慮癥具有治療作用，且已取得了一些初步的研究進(jìn)展〔1，2〕。此外，黃連尚有降糖作用〔3〕。鏈脲佐菌素(STZ)是復(fù)制糖尿病常用的工具藥，而且，現(xiàn)代研究表明，STZ除了誘發(fā)糖尿病之外，尚可引起抑郁和焦慮〔4〕。本研究旨在觀察黃連55%乙醇提取物(CCEE)對(duì)生理狀態(tài)及STZ致病理狀態(tài)下小鼠抑郁和焦慮行為的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、主要藥物與儀器 昆明(KM)小鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔SCXK(豫) 2015-0004〕。黃連：鄭州瑞龍制藥股份有限公司，產(chǎn)地四川，批號(hào)140702，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)科陳隨清教授鑒定確認(rèn)為毛茛科植物黃連(C.chinensisFranch.)的干燥根莖。鹽酸二甲雙胍片：北京京豐制藥集團(tuán)，批號(hào)150715；鹽酸氟西?。撼Ｖ菟乃幹扑幱邢薰?，批號(hào)201410103；STZ：Sigma，貨號(hào)S0130；枸櫞酸(分析純)：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20150201。大小鼠開場活動(dòng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：成都泰盟軟件有限公司，OFT-100；高架十字迷宮視頻分析系統(tǒng)(XR-XG201)，高通量強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(XR-XQ202)，高通量懸尾實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(XR-XX203)；明暗箱實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(XR-XB120)：上海欣欣信息科技有限公司；高速中藥粉碎機(jī)：浙江省永康市溪岸五金藥具廠，HX-200。

1.2CCEE制備 采用黃連根莖粗粉，每1 g黃連粗粉加10 ml體積分?jǐn)?shù)為55%的乙醇(W/V=1∶10)，回流提取2次，每次2 h，4 000 r/min離心10 min，合并離心上清液，回收乙醇至浸膏，55℃減壓干燥，稱重，4℃保存待用。經(jīng)計(jì)算，黃連醇提物得率為26.44%。

1.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)處理 用0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.2)配制STZ注射液，小鼠在禁食16 h后(不禁水)一次性腹腔注射(ip) STZ(150 mg/kg)造糖尿病模型；造模后的小鼠經(jīng)過72 h自由飲食后，于尾靜脈取血用血糖儀測定血糖值(血糖>11.1 mmol/L為糖尿病模型制作成功)，篩選血糖>11.1 mmol/L的小鼠進(jìn)入STZ病理狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)觀測。另取30只小鼠，用于生理狀態(tài)下(非STZ處理)實(shí)驗(yàn)觀測。CCEE給予生理狀態(tài)及STZ病理狀態(tài)下小鼠的劑量均為低劑量(50 mg/kg)和高劑量(200 mg/kg),陽性藥組采用鹽酸二甲雙胍(MH，100 mg/kg)和鹽酸氟西汀(FH，10 mg/kg)聯(lián)合用藥〔灌胃(ig)給藥〕，STZ組和溶媒對(duì)照組只ig給予等量溶媒(0.5%CMC-Na)，各組連續(xù)給藥21 d，末次給藥后1 h進(jìn)行行為學(xué)測試。

1.4開場實(shí)驗(yàn)(OFT)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(EPM)和明暗箱實(shí)驗(yàn)(LDT) OFT：采用OFT系統(tǒng)，將小鼠放于敞箱的中央，觀測小鼠在5 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)時(shí)間和站立次數(shù)。EPM：將小鼠置于裝置的迷宮中央，頭朝開臂，記錄5 min內(nèi)小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)(OE)、進(jìn)入開臂時(shí)間(OT)、進(jìn)入封閉臂次數(shù)(CE)、進(jìn)入封閉臂時(shí)間(CT)，計(jì)算小鼠在300 s內(nèi)的開臂進(jìn)入次數(shù)百分比(OE%)和在開臂滯留時(shí)間百分比(OT%)。LDT：將小鼠置于LDT裝置的明箱一側(cè)，拉出擋板，立即開始記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，觀察記錄小鼠在5 min內(nèi)的穿箱次數(shù)。

1.5懸尾實(shí)驗(yàn)(TST)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST) TST：采用TST系統(tǒng)，距小鼠尾部2 cm處用醫(yī)用膠帶把小鼠尾巴與掛鉤粘貼固定，頭部向下懸掛，實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)置為360 s，記錄小鼠在120～360 s內(nèi)的懸尾不動(dòng)時(shí)間。FST：采用FST系統(tǒng)，將小鼠放于水位為25 cm、水溫為25℃的透明的柱狀圓桶中，實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)置為360 s，記錄小鼠在120～360 s內(nèi)的游泳不動(dòng)時(shí)間。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD法及DunnettT3法。

2 結(jié) 果

2.1CCEE對(duì)生理狀態(tài)及STZ病理狀態(tài)下小鼠OFT運(yùn)動(dòng)時(shí)間和站立次數(shù)的影響 與生理狀態(tài)下的溶媒對(duì)照組比較，CCEE高劑量顯著升高了生理狀態(tài)下小鼠在OFT中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間(P<0.01)，而STZ處理后顯著降低了小鼠在OFT中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間和站立次數(shù)(均P<0.01)；與STZ組比較，陽性藥組和CCEE高劑量組均可顯著升高STZ小鼠在OFT中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間和站立次數(shù)(均P<0.01)，而CCEE低劑量只可顯著升高運(yùn)動(dòng)時(shí)間(P<0.01)，對(duì)站立次數(shù)無明顯影響(P>0.05)。見表1。

表1 CCEE對(duì)生理狀態(tài)及STZ病理狀態(tài)下小鼠抑郁和焦慮行為的影響

與溶媒對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與STZ組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

2.2CCEE對(duì)生理狀態(tài)及STZ病理狀態(tài)下TST和FST不動(dòng)時(shí)間的影響 與溶媒對(duì)照組比較，CCEE高劑量顯著降低了生理狀態(tài)下小鼠在TST和FST中的不動(dòng)時(shí)間(均P<0.05)，而STZ處理后則顯著升高了小鼠在TST和FST中的不動(dòng)時(shí)間(均P<0.01)；與STZ組比較，陽性藥組和CCEE高劑量均可顯著降低STZ小鼠在TST和FST中的不動(dòng)時(shí)間(均P<0.01)，而CCEE低劑量只可顯著降低在TST中的不動(dòng)時(shí)間(P<0.01)，而對(duì)在FST中的不動(dòng)時(shí)間則無明顯影響(P>0.05)。見表1。

2.3CCEE黃連醇提物對(duì)生理狀態(tài)及STZ病理狀態(tài)下小鼠在EPM的OE%和OT%的影響 與溶媒對(duì)照組比較，CCEE高劑量顯著升高了生理狀態(tài)下小鼠在EPM中的OE%(P<0.05)，而STZ處理后則顯著降低了小鼠在EPM中的OE%和OT%(分別P<0.01，P<0.05)；與STZ組比較，陽性藥組和CCEE高劑量均可顯著升高STZ小鼠在EPM中的OE%和OT%(P<0.05或P<0.01)，而CCEE低劑量對(duì)此則均無明顯影響(均P>0.05)。見表1。

2.4CCEE對(duì)生理狀態(tài)及STZ病理狀態(tài)下小鼠LDT穿箱次數(shù)的影響 與溶媒對(duì)照組比較，STZ處理后顯著降低了小鼠在LDT的穿箱次數(shù)(P<0.01)，而CCEE的低劑量和高劑量在小鼠生理狀態(tài)下對(duì)此均無明顯影響；與STZ組比較，陽性藥組、CCEE低劑量及高劑量均可顯著升高STZ小鼠在LDT中的穿箱次數(shù)(分別P<0.01，P<0.05，P<0.01)。見表1。

3 討 論

糖尿病患者飲食受限、生活質(zhì)量下降更易引發(fā)抑郁、焦慮等負(fù)面情緒，終而導(dǎo)致糖尿病并發(fā)抑郁癥或(和)焦慮癥。再者，抑郁癥或(和)焦慮癥患者缺乏運(yùn)動(dòng)且飲食不規(guī)律，服藥依從性差，更加不利于糖尿病的治療，二者之間的相互影響也加大了糖尿病抑郁癥或(和)焦慮癥的治療難度。中醫(yī)藥具有注重整體調(diào)節(jié)、藥物天然易得、多靶點(diǎn)效應(yīng)等特點(diǎn)和優(yōu)勢，能夠有效地降低血糖和預(yù)防糖尿病并發(fā)癥。從中藥中開發(fā)針對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的安全高效藥物，已成為研究熱點(diǎn)之一〔5〕。

TST和FST是抑郁癥及抗抑郁藥篩選常用的實(shí)驗(yàn)測試工具，動(dòng)物在這兩種測試中的不動(dòng)時(shí)間如果明顯升高，常表示動(dòng)物處于行為絕望的抑郁狀態(tài)，反之則表示藥物可能具有抗抑郁作用〔6〕。本研究提示CCEE高劑量對(duì)生理狀態(tài)下小鼠具有抗抑郁作用。STZ可誘導(dǎo)小鼠的抑郁行為，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致〔7〕。CCEE高劑量對(duì)生理狀態(tài)下和STZ糖尿病病理狀態(tài)下小鼠的抑郁行為均有明顯改善作用，而CCEE低劑量只對(duì)STZ糖尿病病理狀態(tài)下小鼠的抑郁行為具有明顯改善作用，而對(duì)生理狀態(tài)下小鼠的抑郁行為無明顯影響，一定程度上提示CCEE對(duì)STZ糖尿病病理狀態(tài)下的抗抑郁作用較對(duì)其生理狀態(tài)下的作用更為敏感。推測這可能與CCEE既可針對(duì)STZ病理狀態(tài)下的高血糖進(jìn)行干預(yù)，又可針對(duì)STZ病理狀態(tài)下的抑郁行為進(jìn)行治療，即與這樣的一種雙重作用有關(guān)。

EPM和LDT是焦慮癥及抗焦慮藥篩選常用的實(shí)驗(yàn)測試工具。動(dòng)物在EPM測試中的OE%或(和)OT%如果明顯降低，常表示動(dòng)物處于焦慮狀態(tài)，反之表示藥物可能具有抗焦慮作用〔8〕；同樣，在LDT測試中的穿箱次數(shù)如果明顯降低，則常表示動(dòng)物處于焦慮狀態(tài)，反之則表示藥物可能具有抗焦慮作用〔7〕。在本研究中，之前CCEE高劑量僅從OE%的分析層面呈現(xiàn)出了明顯的抗焦慮作用，而CCEE低劑量在EPM和LDT測試中均未呈現(xiàn)出抗焦慮作用。STZ處理誘導(dǎo)了小鼠的焦慮行為，這與之前報(bào)道的結(jié)果一致〔9〕。CCEE高劑量對(duì)小鼠在STZ糖尿病病理狀態(tài)下的焦慮行為均具有明顯改善作用；CCEE低劑量只可使該病理狀態(tài)下小鼠在LDT的穿箱次數(shù)顯著升高，提示至少從LDT測試的角度來說，CCEE低劑量對(duì)STZ糖尿病病理狀態(tài)下小鼠的焦慮行為具有明顯改善作用。進(jìn)一步總結(jié)分析可知，CCEE高劑量對(duì)生理狀態(tài)下和STZ糖尿病病理狀態(tài)下小鼠的焦慮行為均有明顯改善作用，而CCEE低劑量只對(duì)STZ糖尿病病理狀態(tài)下小鼠的焦慮行為具有明顯改善作用，而對(duì)生理狀態(tài)下小鼠的焦慮行為無明顯影響，一定程度上提示CCEE對(duì)STZ糖尿病病理狀態(tài)下的抗焦慮作用較對(duì)其生理狀態(tài)下的作用更為敏感。推測這可能與CCEE既可針對(duì)STZ病理狀態(tài)下的高血糖進(jìn)行干預(yù)，又可針對(duì)STZ病理狀態(tài)下的抑郁行為進(jìn)行治療，即與這樣的一種雙重作用有關(guān)。

此外，本研究中，MH和FH聯(lián)合用藥對(duì)STZ病理狀態(tài)下的抑郁和焦慮行為均起到了較好的治療作用，實(shí)際上這不僅與MH的降糖作用及FH的抗抑郁作用有關(guān)，還可能與FH的抗焦慮〔10〕、MH的抗焦慮〔11〕和抗抑郁〔12〕的綜合作用有關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)了CCEE高劑量對(duì)生理狀態(tài)及STZ病理狀態(tài)下小鼠抑郁和焦慮行為均有改善作用，而CCEE低劑量僅對(duì)STZ病理狀態(tài)下小鼠的抑郁和焦慮行為具有改善作用。一定程度上，CCEE對(duì)STZ 糖尿病病理狀態(tài)下的治療作用較對(duì)其在生理狀態(tài)下的治療作用更為敏感。

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