張 健，王景景，謝逸萍，劉美艷

(1.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/整合植物生物研究所，江蘇徐州 221116； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘薯研究中心，江蘇徐州 221121)

甘薯(IomoeabatatasLam)屬旋花科甘薯屬，是重要的糧食、經(jīng)濟(jì)和飼料作物，在全世界范圍內(nèi)廣泛種植[1-3]。我國是甘薯種植面積最大的國家，占世界種植面積的一半以上。甘薯黑斑病是危害甘薯種植和儲(chǔ)藏的重要病害之一，在世界各地甘薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)病[4]。甘薯黑斑病使幼苗期和生長期苗莖基部黑根爛死，儲(chǔ)藏期感染則會(huì)使薯塊出現(xiàn)黑斑，味苦，最后全部腐爛[5]，使甘薯失去應(yīng)用價(jià)值。甘薯黑斑病病原菌為CeratocystisfimbriataEllis et Halsted，屬于真菌病害。植物病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein，PRs)是當(dāng)植物體受病原菌等刺激物刺激后產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)，正常情況下含量并不高，一旦被誘導(dǎo)，含量迅速增加從而提高植物對病蟲害等逆境的防御抵抗能力[6-7]。國內(nèi)外的研究表明，植物幾丁質(zhì)酶被認(rèn)為是一類與植物抗病有著密切關(guān)系的病程相關(guān)蛋白，它參與了植物體內(nèi)防御機(jī)制的很多方面[8-9]。大量研究表明，植物幾丁質(zhì)酶是一類次生代謝物，只有在真菌或病毒的誘導(dǎo)刺激下才會(huì)大量積累，積累到一定量時(shí)作用于真菌等病害，抑制其生長或直接將其殺死來提高植物的抗逆能力[10-12]。本試驗(yàn)的前期工作已經(jīng)利用甘薯黑斑病病菌誘導(dǎo)甘薯大量表達(dá)了幾丁質(zhì)酶，說明甘薯黑斑病抗性與甘薯塊根幾丁質(zhì)酶活性有相關(guān)關(guān)系。核黃素、脫乙酰幾丁質(zhì)、黑斑病病菌處理均能誘導(dǎo)甘薯塊根幾丁質(zhì)酶活性的提高，說明甘薯幾丁質(zhì)酶是一種誘導(dǎo)酶。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，甘薯幾丁質(zhì)酶對甘薯黑斑病病菌具有很強(qiáng)的抑制作用[13]。進(jìn)一步研究甘薯幾丁質(zhì)酶的性質(zhì)，能為甘薯抗黑斑病育種[14]、新型抗黑斑病藥物的開發(fā)和生產(chǎn)上黑斑病的防治[15]提供理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

甘薯黑斑病病菌、南京-92塊根(高抗黑斑病品種)由江蘇省徐州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中國甘薯研究中心提供。

1.2 黑斑病菌孢子懸液的制備

取滅菌過的PDA液體培養(yǎng)基200 mL，接種甘薯黑斑病菌于其中，在(30±1) ℃下，以120 r/min振蕩3 d，過濾除去菌絲，以3 000 r/min離心10 min，重復(fù)3次，直至沉淀基本為白色，經(jīng)鏡檢確認(rèn)為黑斑病菌內(nèi)分生孢子，加適量水懸浮。試驗(yàn)時(shí)，將上述內(nèi)分生孢子配成1×107個(gè)孢子/mL的濃度供接種用。

1.3 薯塊染菌處理

試驗(yàn)時(shí)，選取大小均勻、表面光潔無病斑的塊根，用蒸餾水沖洗3次。將塊根切成1～2 cm厚的圓片，然后將黑斑病菌內(nèi)分生孢子懸浮液涂于塊根圓片的兩側(cè)，于(30±1) ℃暗箱中保溫4 d。

1.4 甘薯幾丁質(zhì)酶的提取和活力測定

將甘薯外表層去除，切成小塊，并迅速將其浸泡于 0.02 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH值5.5)中，甘薯質(zhì)量和緩沖液體積的比例為1 ∶1，用組織搗碎機(jī)將甘薯磨碎，4層紗布過濾，濾液于4 ℃下以8 000 r/min離心15 min，上清即為幾丁質(zhì)酶粗酶液。膠體幾丁質(zhì)的制備按照李世貴等的方法[16]進(jìn)行。DNS溶液的配制按照李合生的方法[17]進(jìn)行。幾丁質(zhì)酶活性測定參照Boller等的方法[7]進(jìn)行。以每小時(shí)分解膠體產(chǎn)生1 μmolN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活力單位(U/mL)。

1.5 甘薯幾丁質(zhì)酶的分子量測定

采用SDS-PAGE測定分子量，按蔡武成等的方法[18]進(jìn)行。

1.6 甘薯幾丁質(zhì)酶的等電點(diǎn)測定

采用圓盤電泳，按蔡武成等的方法[18]進(jìn)行等電點(diǎn)測定，兩性電解質(zhì)pH值為7～10。

1.7 甘薯幾丁質(zhì)酶的最適溫度測定

分別于10、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃下測定幾丁質(zhì)酶活性，3次重復(fù)。以溫度為橫坐標(biāo)，幾丁質(zhì)酶活性為縱坐標(biāo)，得出甘薯幾丁質(zhì)酶活性隨溫度變化的曲線。

1.8 甘薯幾丁質(zhì)酶的最適pH值測定

幾丁質(zhì)酶活性測定體系的pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。其中pH值2.0～6.5是用0.02 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH值7.0～12.0是用0.02 mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。3次重復(fù)。以pH值為橫坐標(biāo)、幾丁質(zhì)酶相對活性為縱坐標(biāo)，得出甘薯幾丁質(zhì)酶活性隨pH值變化的曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯幾丁質(zhì)酶的分子量

從高抗甘薯黑斑病品種南京-92塊根得到粗酶液。經(jīng)熱變性、硫酸銨分級沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析、SephadexG-75凝膠層析純化后，將有幾丁質(zhì)酶活性的條帶進(jìn)行10%、12%PAGE電泳，均顯示為單一條帶(圖1)；說明制備得到了電泳純級的甘薯幾丁質(zhì)酶單一組分。將割膠純化后得到的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳(圖2)，根據(jù)低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白計(jì)算可知甘薯幾丁質(zhì)酶相對分子量為23 ku。

2.2 甘薯幾丁質(zhì)酶的等電點(diǎn)

以凝膠距正極的距離為橫坐標(biāo)，每0.5 cm凝膠的pH平均值為縱坐標(biāo)制作pH值梯度曲線(圖3)。得出回歸方程為y=0.253 2x+7.019 5，r2=0.992 9。幾丁質(zhì)酶經(jīng)圓盤等電聚焦電泳得到1條蛋白帶(圖4)，圓盤等電聚焦電泳膠總長 8 cm，蛋白條帶距負(fù)極端0.7 cm。根據(jù)等電聚焦的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定等電點(diǎn)為pH值7.2，說明該蛋白為堿性蛋白質(zhì)。

2.3 甘薯幾丁質(zhì)酶的最適溫度

從圖5中可以看出，甘薯幾丁質(zhì)酶在10～70 ℃之間都有較強(qiáng)的活性，45 ℃時(shí)酶活性達(dá)到最大，說明45 ℃為是甘薯幾丁質(zhì)酶的最適溫度。

2.4 甘薯幾丁質(zhì)酶最適pH值

從圖6中可以看出，甘薯幾丁質(zhì)酶在pH值4.0～10.0之間都有較強(qiáng)的活性，說明甘薯幾丁質(zhì)酶對于酸堿的耐受力較強(qiáng)；在pH值為2.0時(shí)，此酶完全失去活性，而在pH值為12.0左右時(shí)幾丁質(zhì)酶還保留一些活性；在pH值為5.5時(shí)，酶活性達(dá)到最大，說明pH值5.5為此酶的最適pH值。酶活性在pH值為6.5～7.5 之間下降，主要原因是pH值接近等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)發(fā)生部分沉淀，造成酶活性減小。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對純化得到的甘薯幾丁質(zhì)酶的特性進(jìn)行了研究。SDS-PAGE電泳顯示甘薯幾丁質(zhì)酶的分子量在23 ku左右，這與已報(bào)道過的植物幾丁質(zhì)酶的分子量在20～40 ku之間的結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果表明，甘薯幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度為 45 ℃，在20～70 ℃時(shí)比較穩(wěn)定，當(dāng)溫度超過75 ℃，酶的活性急劇下降；該酶的最適pH值為5.5，在pH值為4.0～10.0比較穩(wěn)定，說明純化的這種甘薯幾丁質(zhì)酶對酸堿的耐受性較強(qiáng)，當(dāng)pH值小于或等于2.0時(shí)幾丁質(zhì)酶失去活性，pH值超過12.0時(shí)活性接近于0；該幾丁質(zhì)酶的等電點(diǎn)為7.2，為堿性幾丁質(zhì)酶，這與在甘蔗[19]和中國水仙[20]中分離得到的幾丁質(zhì)酶的研究結(jié)果一致。

本試驗(yàn)只純化了一種甘薯幾丁質(zhì)酶，由外切幾丁質(zhì)酶活性測定方法可知，這種幾丁質(zhì)酶為外切幾丁質(zhì)酶。很多研究表明，植物體內(nèi)可能存在不止一種幾丁質(zhì)酶[21]，本試驗(yàn)的目的是要獲得對甘薯黑斑病病菌有較強(qiáng)抑制作用的幾丁質(zhì)酶，并且通過體外抑菌試驗(yàn)證明這種幾丁質(zhì)酶對黑斑病有較強(qiáng)的抑制作用，對甘薯體內(nèi)可能存在的其他同工酶將作進(jìn)一步的研究。