董 波，張寄香，戴愛(ài)玲，李曉華，李靜楠，楊小燕

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖 364012； 2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖 364012；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128)

豬病毒性腹瀉病是由1種或多種病毒單獨(dú)或混合感染各年齡段豬所引發(fā)的伴有腹瀉、嘔吐和脫水等典型癥狀的消化道機(jī)能紊亂疾病[1]。豬病毒性腹瀉病主要表現(xiàn)為病豬體溫正?；蛏愿摺⒕癯劣?、食欲減退或廢絕，常常導(dǎo)致豬群生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，死亡率升高，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙畜牧行業(yè)發(fā)展。因此，了解仔豬病毒性腹瀉病的流行局勢(shì)，有助于更有效的施行防治措施。

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和豬輪狀病毒(porcine rotavirus，RV)是引起豬病毒性腹瀉的3種主要病原，均具有較強(qiáng)的傳染性，哺乳仔豬的易感性最強(qiáng)，致死率高[2]。3種病毒皆為接觸性傳播，在致病性和流行病學(xué)上極為相似，皆以嘔吐、腹瀉、脫水為主要特征，臨床上不易分辨。

近年來(lái)，PEDV在我國(guó)多個(gè)省(市、區(qū))的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，是困擾養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一。2011年張世忠等對(duì)福建省各個(gè)地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)豬的頑固性腹瀉病例進(jìn)行檢測(cè)，PEDV感染率高達(dá)52.2%[3]。然而，部分病例存在2種或3種病毒混合感染的情況，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的潛在危害不容忽視。因此，本研究將2014年1月至2016年12月期間送至龍巖學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究所的135例疑似患有病毒性腹瀉仔豬的組織樣品采用RT-PCR進(jìn)行診斷，分析閩西地區(qū)豬病毒性腹瀉的流行狀況，以期為病毒性腹瀉的防控提供資料依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

收集2014年1月至2016年12月福建龍巖及周邊地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)送往龍巖學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究所進(jìn)行診斷，患有腹瀉的仔豬腸道組織及內(nèi)容物，共計(jì)135份。

1.2 主要試劑

DL 2000 Marker、總RNA提取液(TaKaRa RNAiso Reagent)、病毒RNA/DNA提取試劑盒(TaKaRa miniBEST Viral DNA/RNA extraction Kit Ver.3.0)、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、rTaqDNA聚合酶、Oligo(dT)、dNTP、DNA Marker DL 2000、RNA酶抑制劑、pMD19-T Vector購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒(DNA Gel extraction Kit)及質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid Miniprep Kit)購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞制備試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；三氯甲烷、異丙醇采用分析純?cè)噭?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank上發(fā)表的PEDV、TGEV、RV基因序列，使用Premier Premier 5.0生物軟件設(shè)計(jì)合成特異性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物詳情見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4 一步法RT-PCR

按照病毒RNA/DNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0)提供的操作手冊(cè)，自小腸組織及內(nèi)容物中提取總RNA并作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：45 ℃作用30 min，94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定，結(jié)果獲得與預(yù)期大小相同的片段(圖1)。將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒，將陽(yáng)性克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，序列結(jié)果正確。

2.2 PEDV、TGEV和RV的感染情況統(tǒng)計(jì)

對(duì)PEDV、TGEV和RV的感染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯示，PEDV的檢出率最高，達(dá)到30.37%，而TGEV和RV的檢出率分別為13.33%和11.11%(表2)。

表2 PEDV、TGEV和RV的感染情況

2.3 PEDV、TGEV和RV感染的季節(jié)性分布

3種病毒全年均被檢出，PEDV和RV在冬季感染率較高，陽(yáng)性檢出率分別達(dá)到45.95%和16.22%，TGEV在春季的感染率相對(duì)其他季節(jié)較高，其陽(yáng)性檢出率為17.65%(表3)。

表3 各季節(jié)仔豬腹瀉病毒陽(yáng)性檢出率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 PEDV、TGEV和RV年份分布

對(duì)各年份陽(yáng)性檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，PEDV的陽(yáng)性檢出率在2015—2016年間有所下降，仔豬流行性腹瀉病的流行有所減緩；TGEV陽(yáng)性檢出率從2014—2015年期間有明顯下降，至2016年又出現(xiàn)小幅提升；RV的陽(yáng)性檢出率變化不明顯，波動(dòng)平緩(表4)。

表4 各年份陽(yáng)性檢出率統(tǒng)計(jì)

3 討論與結(jié)論

本研究自2014年1月至2016年12月對(duì)閩西地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)中疑似患有病毒性腹瀉疾病的樣品進(jìn)行診斷，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)得出，閩西地區(qū)PEDV、TGEV、RV的陽(yáng)性檢出率依次為30.37%、13.33%和11.11%；PEDV和RV混合感染、TGEV和RV混合感染、PEDV和TGEV混合感染和3種病毒均被感染的陽(yáng)性檢出率分別為3.70%、2.22%、0.74%和 0.74%，與我國(guó)其他地區(qū)檢出率相近[4-5]。已有報(bào)道指出，在2012—2013年期間，閩西地區(qū)PEDV、TGEV、RV的陽(yáng)性檢出率分別為22.9%、25.0%、14.6%[6]。對(duì)比本研究統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，TGEV和RV的陽(yáng)性檢出率有所降低，PEDV的感染率有一定升高，3種病毒混合感染的比例有所降低。同時(shí)，相比全國(guó)近年來(lái)豬感染腹瀉病毒的流行情況，閩西地區(qū)的TGEV、RV的陽(yáng)性率均處于較低水平，而PEDV的陽(yáng)性率仍然高于部分省(市、區(qū))，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)防控[7-8]。

本研究中3種腹瀉病毒在1年中均被檢出，其中PEDV在冬季檢出率最高，為45.95%。春、夏和秋季的檢出率分別為26.47%、20.00%、2.00%，冬、春2季PEDV的檢出率明顯高于夏、秋2季，這一結(jié)果與PEDV在寒冷季節(jié)尤其在冬春季多發(fā)的流行特點(diǎn)相吻合，與我國(guó)部分地區(qū)的檢出情況相似，說(shuō)明寒冷季節(jié)有利于PEDV的感染與傳播[9]。RV在春、夏、秋季的檢出率分別為7.35%、13.33%、13.33%，在冬季檢出率最高，達(dá)到16.22%，與往年閩西地區(qū)檢出情況相比，RV在冬季的檢出率呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，而在春、夏、秋季，RV的感染情況沒(méi)有明顯變化。TGEV的檢出率與全國(guó)大部分地區(qū)的情況相近，與2012—2013年閩西地區(qū)TGEV感染情況相比，檢出率有所下降[6]。通過(guò)對(duì)不同年份陽(yáng)性檢出率統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，閩西地區(qū)PEDV感染率在近些年呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，感染情況有所好轉(zhuǎn)。TGEV在2015年后感染率下降顯著，并保持較為穩(wěn)定的感染情況。而RV的感染率總體波動(dòng)不大，這也與我國(guó)部分省(市、區(qū))RV感染情況相近。

本研究顯示，當(dāng)前閩西地區(qū)以PEDV最為流行，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)影響較大，造成經(jīng)濟(jì)損失更為嚴(yán)重，應(yīng)當(dāng)受到高度重視。同時(shí)，TGEV和RV的感染率雖然相對(duì)較低，仍然應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)防控，不可掉以輕心。因此，在養(yǎng)殖中應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)預(yù)防力度，通過(guò)合理使用藥物提高豬群抵抗力，做好免疫接種[10]。從流行特點(diǎn)來(lái)看，病毒的流行與季節(jié)氣候有一定聯(lián)系，一般在冬、春季較寒冷潮濕的時(shí)期多發(fā)。冬、春季節(jié)由于氣候多變，濕度大，作為傳染源的糞便、乳汁和呼出的氣體等在潮濕的環(huán)境下更容易傳播病毒，攜帶病毒的傳染源污染環(huán)境、飼料、飲水和用具，轉(zhuǎn)而傳入易感群體的消化道和呼吸道[11]。因此，冬春2季更要謹(jǐn)防病毒的滋生，減少應(yīng)激，提高飼料營(yíng)養(yǎng)，改善飼養(yǎng)管理，嚴(yán)格維持舍內(nèi)干燥清潔，定期消毒通風(fēng)。同時(shí)，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整豬舍密度，以便降低傳播速度，對(duì)于哺乳仔豬更應(yīng)加強(qiáng)護(hù)理。