周夢(mèng)宇， 李海芳， 武 鈺， 姚 軍

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011； 2新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所， 烏魯木齊 830004)

棉酚是棉屬植物內(nèi)的一類多酚類物質(zhì)，廣泛分布于棉屬類植物的根、莖、葉和種子的色素腺體細(xì)胞中，其中在棉籽中的含量最高[1]。棉酚按其存在形式可分為游離棉酚(FG)和結(jié)合棉酚(BG)[2]，其中結(jié)合棉酚是經(jīng)游離棉酚與生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)或游離氨基酸結(jié)合而形成的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的化合物，其化學(xué)鍵不易打開(kāi)，通常情況下無(wú)毒[3]。游離棉酚化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在棉籽油的放置過(guò)程中隨溫度和時(shí)間的變化會(huì)發(fā)生降解[4]，產(chǎn)生的降解產(chǎn)物為四甲氧基棉酚[5]，游離棉酚在生物體內(nèi)有蓄積作用，長(zhǎng)期食用會(huì)引起慢性中毒，對(duì)心臟、肝臟、腎臟等實(shí)質(zhì)性器官及神經(jīng)、血管有一定的損害作用，同時(shí)還具有一定的生殖毒性，能夠破壞雄性生物體睪丸生精上皮，導(dǎo)致精子畸形、死亡，造成精子活力降低，還能使雌性生物體子宮缺血、缺氧，造成子宮劇烈收縮引起流產(chǎn)[6-7]。目前游離棉酚的毒性已被證實(shí)[8]，但其降解產(chǎn)物的毒性未見(jiàn)報(bào)道，本研究采用小鼠精子畸變實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂疾焖募籽趸薹拥纳扯拘宰饔?，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器DM2000+ICC50HD型熒光顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)，JA-4003N型電子分析天平(上海菁海儀器有限公司)，HI1220型烘片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)，10212432C型高品質(zhì)顯微鏡蓋玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)，10127125P-G型病理級(jí)顯微鏡載玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)。

1.2試藥四甲氧基棉酚由實(shí)驗(yàn)室自制(新疆醫(yī)科大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心)，環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，批號(hào)161221)，伊紅染液(北京中杉金橋生物科技有限公司，批號(hào)160811)；甲醇(上海市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20111205)；水為超純水，由新疆醫(yī)科大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心提供。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性KM小鼠，6 w齡，體質(zhì)量(30±5)g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證許可證號(hào)：SCXK(新)2016-0005；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證明許可證號(hào)：SCXK(新)2016-0005。KM小鼠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)中，空氣潔凈度為10 000級(jí)，溫度20～23℃，濕度40%～60%，自動(dòng)照明(12 h明，12 h暗)，自由飲食進(jìn)水，適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1動(dòng)物分組與給藥方法將60只小鼠隨機(jī)分成5組?？瞻捉M(40 mg/kg，純化水)、陽(yáng)性對(duì)照組(40 mg/kg，環(huán)磷酰胺)，四甲氧基棉酚高(180 mg/kg)、中(90 mg/kg)、低(45 mg/kg)劑量組，每組小鼠灌胃體積(20 mL/kg體質(zhì)量)，每天1次，連續(xù)給藥5 d。

2.2標(biāo)本制備方法給藥35 d后，采用頸椎脫臼法將小鼠處死，剖開(kāi)小鼠腹部，取出兩側(cè)副睪，放入盛有2 mL生理鹽水的培養(yǎng)皿中，將副睪尾剪成小塊，用吸管輕輕吹打懸浮液5～6次，靜置3～5 min后，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使小鼠精子盡快游出，見(jiàn)圖1。使用4層擦鏡紙過(guò)濾后吸取組織濾液于玻片上，用蓋玻片均勻涂開(kāi)，溶液經(jīng)甲醇固定5 min后干燥，用1%～2%伊紅染液染色1 h，固定在玻片架上空氣干燥。

圖1 小鼠雙側(cè)副睪標(biāo)本的制備圖

2.3閱片方法將干燥后的玻片先放在低倍鏡下觀察，找到背景清晰，精子數(shù)量少，精子染色較好的視野，再轉(zhuǎn)換成40倍高倍鏡進(jìn)行觀察。本實(shí)驗(yàn)共分為5組，顯微鏡下精子計(jì)數(shù)，每1毫升小鼠精液中有500個(gè)精子，每組共檢測(cè)6 000個(gè)精子。小鼠精子畸形主要表現(xiàn)在頭部，其次在尾部，精子頭部與其他精子或碎片重疊、有頭無(wú)尾、輪廓不清或明顯的認(rèn)為剪碎者均不能計(jì)算為異常精子。異常精子均應(yīng)記錄顯微鏡的坐標(biāo)，以備復(fù)查，并分別記錄異常類型，以便統(tǒng)計(jì)小鼠精子畸形率及小鼠精子畸形類型的構(gòu)成比。當(dāng)判斷異常精子為雙頭或雙尾畸形時(shí)，要注意與2條精子的部分重疊相鑒別，當(dāng)判斷無(wú)定形精子時(shí)，要與折疊或人為剪碎相鑒別。

3 結(jié)果

3.1小鼠精子閱片與鏡檢結(jié)果對(duì)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠精子進(jìn)行顯微檢查，小鼠精子畸形類型主要有香蕉形、胖頭、雙尾等，見(jiàn)圖2。

a: 正常小鼠精子 b: 香蕉型小鼠精子 c: 胖頭小鼠精子 d: 雙尾小鼠精子

圖2正常小鼠精子及畸形小鼠精子圖(×40)

3.2小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果與空白組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、四甲氧基棉酚高、中、低劑量組小鼠精子畸形率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 小鼠精子畸形檢測(cè)結(jié)果

注：與空白組比較，*P<0.05。

4 討論

游離棉酚的生殖毒性可導(dǎo)致雄性生物永久性不育[9-10]，由于四甲氧基棉酚是通過(guò)游離棉酚降解轉(zhuǎn)變而來(lái)的，化學(xué)結(jié)構(gòu)的母核與游離棉酚基本一致，毒性研究主要從生殖毒性入手。精子畸形試驗(yàn)是檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)能否破壞哺乳動(dòng)物精子正常形態(tài)的實(shí)驗(yàn)方法，由于生物體生殖系統(tǒng)的高敏感性，能夠反映出該化學(xué)物質(zhì)的生殖毒性和對(duì)生殖細(xì)胞潛在的致突變性[11]。實(shí)驗(yàn)劑量下的四甲氧基棉酚能夠引起小鼠精子畸形，并且隨著濃度的增大，小鼠精子畸形率也相對(duì)增加，說(shuō)明四甲氧基棉酚具有與游離棉酚相似的生殖毒性，但是否對(duì)機(jī)體存有其他毒性以及作用機(jī)制，還需進(jìn)一步研究。