阿依先木·海比布， 麥合蘇木·艾克木， 阿依古·吐熱克， 買(mǎi)買(mǎi)提江·阿依丁， 巴圖爾·伊明， 阿不都熱依木·玉蘇甫

(新疆醫(yī)科大學(xué)1維吾爾醫(yī)學(xué)院; 2中心實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011; 3新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)民族醫(yī)藥管理局， 烏魯木齊 830001)

神香草(HyssopusofficinalisL.)是唇形科植物歐神香草的干燥全草，含揮發(fā)油、鞣質(zhì)、樹(shù)脂、黃酮類和其他的物質(zhì)[1-2]，具有祛痰、止咳、平喘、解痙、抗衰老、抑菌、抗血小板等藥理作用[3-8]。臨床上多用于感冒、發(fā)熱、咳嗽、濕寒性和黏液質(zhì)性呼吸器官疾病，如寒性哮喘，咳嗽感冒，濕性痰多，胸膜炎，氣管炎，肺炎及水腫的治療[9]。本課題組前期研究表明，神香草總黃酮(SXCF)具有抗炎、平喘、止咳及祛痰作用，并呈劑量依賴性，能夠改善哮喘模型大鼠肺功能和肺組織病理改變，降低肺泡灌洗液(BALF)中Ly、Eos、Neu及TGF-β1水平等，減輕哮喘氣道炎癥[10]。本研究在建立哮喘模型大鼠的基礎(chǔ)上干預(yù)SXCF，觀察大鼠肺組織病理學(xué)改變，檢測(cè)大鼠血清免疫球蛋白E(IgE)水平，觀察SXCF對(duì)大鼠哮喘模型的影響，并利用核磁共振波譜(1H-NMR)技術(shù)探討SXCF對(duì)哮喘模型大鼠血清代謝物的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器C2500-R-230V型高速離心機(jī)(美國(guó)Labnet公司)，ICV-450型電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE公司)，MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)，W004型壓縮式霧化器(江蘇富林醫(yī)療設(shè)備有限公司)，Inova-600型核磁共振波譜儀(美國(guó)Varian公司)，GS-15R型低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，DW-86L286型超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司)，WG-1000-7型核磁管(美國(guó)Wilmad-Labglass公司)，BSA224S-CW型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，RM2245型病理切片機(jī)(德國(guó)Leica公司),100-04型圖像分析儀(德國(guó)Leica公司),DM 3000型顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2試劑SXCF(含量50%以上)由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥分實(shí)驗(yàn)室自制。卵清蛋白(OVA，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)A-5253)，20%氫氧化鋁膠生理鹽水(齊魯動(dòng)物保健品有限公司，批號(hào)1507006)，醋酸地塞米松(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)151288)，0.9%氯化鈉注射液(國(guó)藥集團(tuán)新疆制藥有限公司，批號(hào)1608008)，4%多聚甲醛固定液(北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)AR10680)，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海莼試生物技術(shù)有限公司，批號(hào)C0106)，重水(美國(guó)CIL公司，批號(hào)R03010104)，大鼠免疫球蛋白E(IgE)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號(hào)E-EL-R0517c)。

1.3藥材神香草藥材2016年6月購(gòu)買(mǎi)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院藥房，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院制劑中心質(zhì)檢定為神香草(HyssopusofficinalisL.)的干燥地上部分。

1.4動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±30)g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心[合格證號(hào)：SCXY(新)2011-0003]。

2 方法

2.1動(dòng)物分組、造模及給藥將60只大鼠，隨機(jī)分為6組，分別為正常對(duì)照組、哮喘模型組、陽(yáng)性(地塞米松)對(duì)照組及SXCF低、中、高劑量組，每組10只。各組動(dòng)物均在清潔動(dòng)物房?jī)?nèi)室溫下相對(duì)濕度60%～80%，溫度(26±3)℃，用普通飼料飼養(yǎng)，自由飲食水。將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，于第1、8天，正常對(duì)照組生理鹽水以1 mL 腹腔注射，其余組均以腹腔注射10%卵清蛋白混合溶液(10 g OVA+氫氧化鋁膠生理鹽水100 g)1 mL致敏，從實(shí)驗(yàn)第15天開(kāi)始正常對(duì)照組(生理鹽水0.3 mg/kg體質(zhì)量)、哮喘模型組(生理鹽水0.3 mg/kg體質(zhì)量)、陽(yáng)性對(duì)照組(醋酸地塞米松0.3 mg/kg體質(zhì)量)、SXCF低、中、高劑量組(SXCF0.8、0.4、0.2 g/kg體質(zhì)量)灌胃給藥[11]，30 min后分別置于密閉式定制有機(jī)玻璃霧化箱內(nèi)，正常對(duì)照組用生理鹽水霧化吸入 20 min，其余組均以10% OVA霧化吸入 20 min激發(fā)引喘，每天1次，連續(xù)16 d。

2.2標(biāo)本采集由大鼠腹主動(dòng)脈采血，收集好各組大鼠血液樣本在4℃,3 000 r/min離心10 min，分離血清，置于-80℃冰箱保存，用于大鼠血清IgE水平測(cè)定。取大鼠右肺中葉，以4%多聚甲醛溶液固定，組織石蠟包埋，按內(nèi)1/3處進(jìn)行連續(xù)切片(切片厚度約3 μm)，以HE染色試劑盒進(jìn)行染色，觀察肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

2.3大鼠血清Ig-E水平檢測(cè)按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)各組大鼠血清IgE水平。

2.41H-NMR大鼠血清樣品的處理將大鼠血清室溫解凍后，取200 μL，混于400 μL磷酸緩沖液(0.9 g NaCl，882.98 g K2HPO4，141.8 g NaH2PO4配成100 mL，pH值為7.4,以重水溶解)，室溫放置10 min后，4℃,10 000 r/min離心10 min，取550 μL上清液轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中，待檢。

2.51H-NMR數(shù)據(jù)采集與預(yù)處理采用核磁共振波譜儀對(duì)大鼠血清進(jìn)行1H-NMR檢測(cè)，頻率600 MHz，采掃描次數(shù)128次，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)32 k，譜寬10 000 Hz，采樣延遲2 s,采樣時(shí)間1.64 s,測(cè)試溫度 25℃，用預(yù)飽和方式來(lái)壓制水峰。以乳酸(δ 1.32)質(zhì)子信號(hào)作為化學(xué)位移參考峰的位置后調(diào)整基線。將1H-NMR譜圖在化學(xué)位移 δ 0.5～9.0 ppm范圍內(nèi)以δ 0.003 ppm積分區(qū)間進(jìn)行分段積分，剪去4.7～5.2 ppm的水峰。將所出現(xiàn)的所有積分?jǐn)?shù)據(jù)用Excel文件格式保存，所得到的數(shù)據(jù)文件用SIMCA-P+11(瑞典Umetries公司)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行偏最小二乘判別式法分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA) 進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1哮喘模型大鼠的一般狀態(tài)除正常對(duì)照組大鼠外，哮喘模型組大鼠、陽(yáng)性對(duì)照組和SXCF低、中、高劑量組大鼠在霧化激發(fā)過(guò)程中均出現(xiàn)皮膚瘙癢、撓鼻、腹式呼吸、仰頭呼吸、張口呼吸、呼吸頻率加速加深、焦躁不安、四肢癱軟及行動(dòng)遲緩等現(xiàn)象，造模過(guò)程中無(wú)一只大鼠死亡。

3.2肺組織HE染色觀察正常對(duì)照組大鼠支氣管上皮組織完整，肺泡間隔及腔內(nèi)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。哮喘模型組大鼠細(xì)小支氣管壁及伴行血管周?chē)醒装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞為主，肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞滲出，氣道黏膜皺褶增多，出現(xiàn)黏膜脫落情況，平滑肌增厚，管腔變窄，部分肺泡壁斷裂，融合成肺氣腫，肺大泡。與正常對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和SXCF低、中、高劑量組大鼠上述病理情況有所減輕，見(jiàn)圖1。

3.3大鼠血清IgE水平的檢測(cè)結(jié)果與正常對(duì)照組比較，哮喘模型組大鼠血清IgE水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與哮喘模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和SXCF低、中、高劑量組大鼠血清IgE水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

A: 正常對(duì)照組

B: 陽(yáng)性對(duì)照組

C: 哮喘模型組

D: SXCF高劑量組

E: SXCF中劑量組

F: SXCF低劑量組

圖1 各組大鼠肺組織HE染色圖(×200倍)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與哮喘模型組比較，#P<0.05；與SXCF高劑量組比較，△P<0.05

3.41H-NMR分析結(jié)果

3.4.1 大鼠血清中主要代謝物的1H-NMR歸屬 通過(guò)1H-NMR譜圖對(duì)6組大鼠血清中的差異性代謝產(chǎn)物成分信號(hào)進(jìn)行了判別分析及歸屬。差異性的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物有亮氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸、甘氨酸、α葡萄糖、β葡萄糖、肉堿、丙酮、谷氨酸、肌酸、不飽和脂類等代謝產(chǎn)物含量發(fā)生變化。這些代謝物存在于氨基酸代謝、糖代謝和脂類代謝，能量代謝等對(duì)機(jī)體重要的多種生物化學(xué)轉(zhuǎn)化的過(guò)程，故可將1H-NMR譜圖作為哮喘大鼠血清代謝指紋圖譜，用來(lái)描述大鼠機(jī)體病理狀況下內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化。各組大鼠血清1H-NMR譜圖及化合物化歸屬見(jiàn)圖2、表2。

(注：A: 正常對(duì)照組；B: 陽(yáng)性對(duì)照組；C: 哮喘模型組；D: SXCF高劑量；E: SXCF中劑量組；F: SXCF低劑量組)

圖2各組大鼠血清1H-NMR譜圖

3.4.2 模式識(shí)別分析結(jié)果 將1H-NMR譜圖分段積分后得出的積分值以PLS-DA和OPLS-DA法進(jìn)行分析，得到大鼠血清1H-NMR譜圖的3D空間圖與平面散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖3。在SIM CA-P+軟件中，通過(guò)R2X、R2Y和Q2來(lái)表示實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所建立模型的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。其中R2是所解釋的模型差異,Q2是所預(yù)測(cè)的模型差異。R2、Q2值越接近于1，代表模型擬合度越好，越小代表模型擬合度越差，一般認(rèn)為模型的預(yù)測(cè)結(jié)果達(dá)到“良”的標(biāo)準(zhǔn)必須要Q2>0.4。PLS-DA分析結(jié)果顯示R2X=0.674， R2Y=0.532，Q2=0.467；Q2>0.4時(shí)可以認(rèn)為模型有一定的可靠性，說(shuō)明各組大鼠血清代謝成分上有差異性。從標(biāo)本空間分布情況可以看出各組大鼠血清代謝輪廓區(qū)完全分開(kāi)，各組標(biāo)本的代謝物存在顯著性的差異。從OPLS-DA圖來(lái)看，正常對(duì)照組與哮喘模型組，哮喘模型組與陽(yáng)性對(duì)照組， SXCF高劑量組與哮喘模型組，SXCF中劑量組與哮喘模型組，SXCF低劑量組與哮喘模型組的分布區(qū)域是完全分開(kāi)的，無(wú)交叉，無(wú)重疊，Q2值依次為0.72、0.923、0.867、0.941、0.918?？臻g分布圖(a)和散點(diǎn)圖(b)中橫縱坐標(biāo)是沒(méi)有單位的標(biāo)尺，表示2個(gè)主成分，每個(gè)點(diǎn)代表每一個(gè)樣本，2組之間無(wú)交叉，無(wú)重疊，分成2類，說(shuō)明有差異，見(jiàn)圖4～8。

(注：■正常對(duì)照組； ●陽(yáng)性對(duì)照組； ◆哮喘模型組； ■SXCF高劑量組； ▲SXCF中劑量組； ★SXCF低劑量組)

圖31H-NMR譜圖PLS-DA分析3D空間分布圖

(注：■正常對(duì)照組；●哮喘模型組)

(注：■地塞米松組；●哮喘模型組)

3.4.3 各組大鼠血清代謝物差異性的比較 與正常對(duì)照組比較，哮喘模型組大鼠血清代謝物中亮氨酸、丙氨酸、乙酸、谷氨酸、肌酸、甘氨酸、肉堿、α葡萄糖、β葡萄糖化合物含量降低，乳酸、不飽和脂類、丙酮含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與哮喘模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清代謝物中亮氨酸、谷氨酸、乳酸、α葡萄糖、β葡萄糖化合物含量升高，肌酸、丙酮、不飽和脂類含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。與哮喘模型組比較，SXCF高劑量組大鼠血清代謝物中亮氨酸、乙酸、谷氨酸、肌酸、甘氨酸、肉堿、β葡萄糖含量升高，乳酸、丙酮、不飽和脂類含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)； SXCF中劑量組大鼠血清代謝物中亮氨酸、谷氨酸、肉堿、肌酸、β葡萄糖含量升高，乳酸、丙酮含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； SXCF低劑量組大鼠血清代謝物中亮氨酸、乙酸、谷氨酸、肌酸、丙氨酸、α葡萄糖、甘氨酸、肉堿、β葡萄糖含量升高，乳酸、丙酮、不飽和脂類含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

(注：■哮喘模型組；●SXCF高劑量組)

(注：■哮喘模型組，●SXCF中劑量組)

(注：■哮喘模型組，●SXCF低劑量組)

序號(hào)代謝物化學(xué)位移相關(guān)系數(shù)正常組/模型組陽(yáng)性對(duì)照組/模型組模型組/SXCF高劑量組模型組/SXCF中劑量組模型組/SXCF低劑量組1極低密度脂蛋白0.88(m)-0.80-0.76-0.97-0.98-0.981.27(m)1.57(m)2.00(m)2.22(m)2.75(m)2乳酸1.32(d) 0.57 0.80-0.88-0.97-0.674.11(q)3丙氨酸1.47(d)-0.55 0.38 0.663.76(q)4亮氨酸1.72(m)-0.80-0.73 0.92 0.95 0.955乙酸1.91(s)-0.76 0.83 0.866谷氨酸2.14(s)-0.65-0.49 0.55 0.86 0.897丙酮2.23(s) 0.88 0.83-0.96-0.97-0.988肉堿2.45(q)-0.76 0.80 0.86 0.939肌酸3.03(s)-0.76-0.79 0.86 0.86 0.7910b 葡萄糖3.24(dd)-0.56 0.93 0.73 0.85 0.783.40(t)3.49(t)3.90(dd)4.64(d)11a 葡萄糖3.53(dd)-0.54 0.69 0.85 0.673.72(dd)5.23(d)12甘氨酸3.56(s)-0.71 0.87 0.9213不飽和脂類5.30(m) 0.93 0.75-0.86 0.85-0.98

注：S為單峰，d為雙重峰，t為三重峰，q為四重峰，m為多峰 ，dd為雙重雙重峰。

4 討論

本研究結(jié)果表明大鼠哮喘模型建立成功，SXCF可通過(guò)抗炎、止咳、平喘作用來(lái)降低大鼠血清IgE，改善大鼠肺組織病理改變，減輕氣道炎癥。從1H-NMR結(jié)果來(lái)看，哮喘模型組以大鼠血清中的能量代謝，氨基酸，糖代謝等多種代謝途徑紊亂為主。SXCF干預(yù)后情況有所改善，SXCF可能通過(guò)影響并調(diào)節(jié)大鼠機(jī)體內(nèi)的各種代謝通路出現(xiàn)的紊亂即蛋白質(zhì)代謝有關(guān)的亮氨酸，脂肪代謝有關(guān)的不飽和脂肪酸、能量代謝有關(guān)的葡萄糖等代謝物而起到減輕大鼠機(jī)體的消耗性狀態(tài)，改善通氣和換氣功能，改善缺氧狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體免疫。本研究將為神香草提取物的抗哮喘作用研究提供依據(jù)。