張 玲, 孟慶軍,賈索爾·肖克熱提, 李 楊, 王雪生, 周賢惠, 湯寶鵬

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟起搏與心電生理科， 烏魯木齊 830054)

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea，OSA)是一種上氣道阻塞引起的疾病，可引起明顯的氣道甚至氣管的阻塞，是許多心血管疾病的危險(xiǎn)因素并和糖尿病、腦卒中等多種疾病相關(guān)[1-3]。已有研究顯示心房顫動(dòng)和OSA明顯相關(guān)[4-9]。OSA可能促進(jìn)房顫的誘發(fā)和維持[10-11]， OSA也是房顫轉(zhuǎn)復(fù)和射頻消融失敗的獨(dú)立因素[5,9]。但其發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明，圍繞OSA展開的臨床和基礎(chǔ)研究成為了研究的新熱點(diǎn)。如何科學(xué)地復(fù)制穩(wěn)定、可靠、接近臨床病理生理狀態(tài)的動(dòng)物模型成為關(guān)鍵問題。本實(shí)驗(yàn)擬通過模擬睡眠呼吸暫?；颊叩牟±砩磉^程(如上氣道塌陷、間歇缺氧)建立OSA相關(guān)房顫的慢性動(dòng)物模型并探討其對(duì)心房電生理及顯微結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇成年比格犬12只，體質(zhì)量10～15 kg，雄性，由南京亞東實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供【許可證號(hào)SCXK (蘇) 2013-0001】。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院使用管理倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(許可證號(hào):IACUC-20130514001)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑LEAD-7000多道電生理記錄儀(四川錦江電子科技有限公司)，DF-4A型心臟電生理刺激儀(蘇州中國東方電子儀器廠)，BeneviewT5多功能監(jiān)護(hù)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，Aaeon7200A呼吸麻醉機(jī)(北京誼安醫(yī)療系統(tǒng)股份有限公司)，i-STAT300血?dú)夥治鰞x(美國雅培公司)。戊巴比妥鈉(Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)CAS57-33-0)；鹿醒寧注射液(吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司，規(guī)格2 mL：250 mg，生產(chǎn)批號(hào)CAS151207)；陸眠寧注射液(鹽酸賽拉嗪注射液，吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司，規(guī)格2 mL：500mg，生產(chǎn)批號(hào)CAS151207)；舒泰50注射液(注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮，法國維克有限公司，生產(chǎn)批號(hào)500000000038072)。

1.3犬慢性阻塞性睡眠呼吸暫停動(dòng)物模型的建立

1.3.1 動(dòng)物麻醉及準(zhǔn)備 所有犬在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性飼養(yǎng)至少1 w，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，6 h禁飲。予以舒泰0.05 mL/kg和速眠新(0.1mL/kg)肌注誘導(dǎo)麻醉，3%的戊巴比妥鈉溶液2 mL/h通過輸液泵維持麻醉。仰臥位插入氣管插管，用以夾閉造成呼吸暫停[12-13]。股靜脈插管維持靜脈通道，肝素鹽水靜滴，避免血栓形成。股動(dòng)脈連于壓力換能器，監(jiān)測血壓及采血?dú)?，右?cè)頸靜脈用4 F電極插入進(jìn)右房以測量有效不應(yīng)期(ERP)。通過lead7000電生理儀持續(xù)監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)體表肢體心電圖(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF)。

1.3.2 阻塞性睡眠呼吸障礙模型的建立 實(shí)驗(yàn)前予以舒泰0.05 mL/kg和速眠新(0.1 mL/kg)肌注誘導(dǎo)麻醉。仰臥位插入內(nèi)徑7.5 mm氣管插管，用繃帶固定于上頜。觀察睫毛反射消失進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中給予3%的戊巴比妥鈉溶液2 mL/h維持麻醉(圖1)。實(shí)驗(yàn)中呼吸暫停通過呼氣末用橡皮塞堵住氣管插管完成。干預(yù)開始,設(shè)定第1周的封堵時(shí)間為1 min，通氣時(shí)間為9 min；第2周的封堵時(shí)間為1 min，通氣時(shí)間為8 min；第3周的封堵時(shí)間1 min，通氣時(shí)間為7 min；第4周的封堵時(shí)間1 min，通氣時(shí)間6 min；第5～12周封堵時(shí)間1 min；通氣時(shí)間5 min，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每天在持續(xù)麻醉下連續(xù)進(jìn)行4 h，一共持續(xù)3個(gè)月[14]。

1.4血?dú)夥治鰟?dòng)脈血?dú)鈴念i動(dòng)脈中抽取，分別于造模前，第1、2、3個(gè)月末氣管夾閉前及夾閉1 min即將結(jié)束的即刻采集動(dòng)脈血測量pH值，二氧化碳分壓(PCO2)和氧分壓(PO2)。所有的血液樣本均在采樣后1 min之內(nèi)測量。

1.5電生理測量分別于干預(yù)前及3個(gè)月末行頸靜脈穿刺下電生理檢查，麻醉狀態(tài)下行右側(cè)頸靜脈穿刺，進(jìn)行電生理檢查，測量ERP和房顫誘發(fā)率。

心內(nèi)電生理圖的監(jiān)測下，將電極插至右心房，心內(nèi)電生理圖上出現(xiàn)大A小V波，表示電極插入成功，將電極固定，以高出基礎(chǔ)心率20%的頻率起搏，測定心房起搏閾值，脈寬設(shè)置為0.5 ms。每次氣管夾閉前以起搏閾值10倍為輸出電壓，通過程序刺激S1S2測定心房ERP, S1S2間期每次降低10 ms，接近ERP后逐漸以1 ms降低直至ERP測出。后在氣管插管夾閉的1 min期間進(jìn)行固定間期S1S2刺激，S1S2間期為氣管夾閉前ERP數(shù)值，每次刺激間隔2 s，直至出現(xiàn)傳導(dǎo)反應(yīng)或AF，后將S1S2間期繼續(xù)縮短5 ms再行程序刺激直至1 min結(jié)束。AF定義為快速而不規(guī)則的心房激動(dòng)，同時(shí)，心室呈不規(guī)則反應(yīng)，R-R間期絕對(duì)不等，持續(xù)超過1 s[12]。所有犬均在高位右房接受程序刺激以測量ERP和AF持續(xù)時(shí)間。

1.6組織學(xué)處理在持續(xù)OSA造模12 w后，處死動(dòng)物，取心肌組織以多聚甲醛固定保存，石蠟切片，利用HE染色、顯微鏡觀察組織的結(jié)構(gòu)和形態(tài)改變。透射電鏡標(biāo)本的制備：犬處死后立即取心肌及神經(jīng)標(biāo)本，用鋒利雙刃刀片切成小于1 mm3小塊，迅速置于戊二醛和四氧化鋨中固定1 h，常規(guī)漂洗，丙酮梯度脫水，包埋，采用超薄切片機(jī)切片，鉛鈾雙重染色，于透射電鏡(JEM-100 CXII)下觀察。

2 結(jié)果

2.1動(dòng)物生命體征的觀察OSA建模過程中，所有犬均可發(fā)現(xiàn)口唇及舌明顯發(fā)紺，呼吸暫停并胸腹反常呼吸運(yùn)動(dòng)?；謴?fù)自主呼吸后，出現(xiàn)呼吸加快，數(shù)個(gè)呼吸后口唇及舌恢復(fù)紅潤。慢性模型犬非實(shí)驗(yàn)階段早期出現(xiàn)厭食，精神欠佳，營養(yǎng)補(bǔ)充及適應(yīng)1 w左右，活動(dòng)正常，反應(yīng)靈敏，食欲恢復(fù)，無體質(zhì)量減輕，精神狀態(tài)好，活潑好動(dòng)。

2.2血?dú)夥治鼋Y(jié)果第1個(gè)月末與未干預(yù)時(shí)，第2個(gè)月末與第1個(gè)月末，第3個(gè)月末與第2個(gè)月末氣管插管阻塞前的血?dú)獗容^，PCO2值顯著升高，PO2、pH值顯著降低(P<0.05)。氣管阻塞后各時(shí)間段之間比無明顯差異(P>0.05)。造模前、第1個(gè)月末，第2個(gè)月末，第3個(gè)月末、氣管阻塞后與氣管阻塞前比較均出現(xiàn)PCO2值顯著升高，PO2、pH值顯著降低(P<0.01)。隨著造模時(shí)間的延長，呼吸暫停的程度逐漸加重。以上結(jié)果表明呼吸暫停模型構(gòu)建成功，見表1。

表1 干預(yù)前及干預(yù)第1、2、3個(gè)月末后的動(dòng)脈血?dú)夥治?/p>

注: 與呼吸暫停前比較，*P<0.05； 與基礎(chǔ)狀態(tài)比較，◇P<0.05； 與第1個(gè)月末比較，△P<0.05； 與第2個(gè)月末比較，▲P<0.05。

2.3電生理指標(biāo)結(jié)果在慢性O(shè)SA犬模型組,基線狀態(tài)幾乎無房顫發(fā)生，隨著OSA時(shí)間的延長，房顫持續(xù)時(shí)間明顯延長(圖2)。OSA造模3個(gè)月后較基礎(chǔ)狀態(tài)相比出現(xiàn)ERP的縮短和房顫持續(xù)時(shí)間的延長(圖3)。房顫的持續(xù)時(shí)間采用連續(xù)測量1 h的房顫總持續(xù)時(shí)間。

2.4組織學(xué)的影響1個(gè)月后OSA組即可出現(xiàn)心房肌細(xì)胞排列紊亂(圖4)，隨著OSA時(shí)間的延長，心房肌結(jié)構(gòu)紊亂明顯加重。3個(gè)月后可見部分心肌纖維斷裂、溶解，壞死部位肌間質(zhì)線粒體聚集，線粒體大小、形態(tài)不一，部分線粒體腫脹，脊膜結(jié)構(gòu)不清晰，部分線粒體萎縮、體積縮小(圖5)。

圖2 犬在基礎(chǔ)狀態(tài)下電生理圖(a)和給予阻塞性呼吸暫停+程序刺激后誘發(fā)房顫圖(b)

圖3 慢性O(shè)SA犬模型組，OSA造模3月后較基礎(chǔ)狀態(tài)相比出現(xiàn)ERP的縮短(a)和AF持續(xù)時(shí)間的延長(b)。

基線狀態(tài)

1個(gè)月末

2個(gè)月末

3個(gè)月末

圖41個(gè)月后心房肌細(xì)胞即可出現(xiàn)明顯排列紊亂,隨著OSA時(shí)間的延長，心房肌結(jié)構(gòu)紊亂明顯加重。

a: 正常心房肌細(xì)胞 可見肌纖維排列整齊，肌節(jié)結(jié)構(gòu)完整完整，肌纖維間線粒體形態(tài)規(guī)則、排列齊。

b: OSA造模3個(gè)月后部分心肌纖維斷裂、溶解，壞死部位肌間質(zhì)線粒體聚集，線粒體大小、形態(tài)不一，部分線粒體腫脹，脊膜結(jié)構(gòu)不清晰，部分線粒體萎縮、體積縮小

圖5正常心房肌細(xì)胞及OSA造模3個(gè)月后心肌細(xì)胞

3 討論

3.1OSA與心房顫動(dòng)的關(guān)系及OSA并發(fā)房顫的機(jī)制OSA可由反復(fù)呼吸道阻塞引起胸內(nèi)壓降低伴左室跨壁壓和后負(fù)荷增加，伴低氧血癥和高碳酸血癥，心房擴(kuò)張結(jié)構(gòu)重構(gòu)，炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，自主神經(jīng)張力異常等[15-16]，最終引起房顫的發(fā)生及維持[17]。房顫患者中OSA的發(fā)病率約為35%[11]，表明可能促進(jìn)房顫的發(fā)生并參與其維持。但OSA的病理生理機(jī)制及OSA伴發(fā)房顫的機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)脈血?dú)夥治鲎C實(shí)有低氧血癥和高碳酸血癥，pH值降低，且隨著OSA 造模時(shí)間的延長而逐漸加重。與之前的研究結(jié)果一致[12,14]，證明造模成功。Ghias等[13]在犬的急性O(shè)SA模型中發(fā)現(xiàn)在房顫發(fā)生前，神經(jīng)叢活性明顯增強(qiáng)，在神經(jīng)叢消融和給予神經(jīng)阻滯劑后房顫誘發(fā)率明顯降低。提示自主神經(jīng)張力變化是決定房顫發(fā)生與否及ERP變化的重要機(jī)制。我們實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)呼吸暫停的同時(shí)伴隨心率減慢及血壓降低，在通氣的即刻出現(xiàn)血壓的驟升和心率增快，提示伴隨自主神經(jīng)張力的明顯變化。而這種效應(yīng)受麻醉深度的影響很大，如麻醉過深神經(jīng)過度抑制則無電生理指標(biāo)明顯變化，說明相對(duì)恒定的麻醉深度且麻醉不宜過深是實(shí)驗(yàn)成功的保證。

ERP反映心房有效不應(yīng)期，ERP延長則房顫不易發(fā)生，縮短則更易發(fā)生房顫。在本模型中ERP隨著呼吸暫停時(shí)間的延長逐漸減低，而房顫持續(xù)時(shí)間則逐漸增加，證實(shí)OSA對(duì)房顫的發(fā)生起著促進(jìn)作用。并在一些情況下，房顫持續(xù)5～10 min以上仍然難以自行終止，給予超速刺激仍難以終止，而給予吸氧后卻能迅速終止房顫。提示OSA的治療有利于房顫的終止。

以往的研究尚無慢性O(shè)SA模型的心房肌病理改變的相關(guān)研究，我們的研究顯示慢性犬OSA模型心房肌結(jié)構(gòu)明顯紊亂，部分心肌纖維斷裂、溶解，部分線粒體腫脹，脊膜結(jié)構(gòu)不清晰，部分線粒體萎縮、體積縮小。提示OSA引起的組織超微結(jié)構(gòu)的改變是房顫發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

3.2OSA模型的建立建立穩(wěn)定而適合電生理研究的OSA動(dòng)物模型是研究疾病病理生理機(jī)制及藥物干預(yù)及其他治療的基礎(chǔ)和條件?；谇捌趯W(xué)者們的研究結(jié)果，本研究選用犬建模，經(jīng)驗(yàn)證動(dòng)物模型穩(wěn)定，操作簡單，可重復(fù)性佳。研究建立犬慢性O(shè)SA基礎(chǔ)上的房顫模型是符合建模標(biāo)準(zhǔn)的，為進(jìn)一步研究OSA基礎(chǔ)上的房顫研究奠定了基礎(chǔ)。本研究借鑒Zhao等[14]的方法通過反復(fù)給比格犬氣管插管，并連續(xù)呼吸暫停的方法構(gòu)建了呼吸暫停模型，以研究慢性O(shè)SA模型的電生理特點(diǎn)。慢性O(shè)SA模型實(shí)驗(yàn)過程中我們觀察到動(dòng)物口唇及舌發(fā)紺伴胸腹式反常呼吸運(yùn)動(dòng)，呼吸暫停后恢復(fù)通氣前出現(xiàn)血氧飽和度降低及氧分壓降低及二氧化碳分壓增加。造模過程中分別對(duì)基礎(chǔ)，造模1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月的動(dòng)物進(jìn)行血?dú)鉁y定，證實(shí)犬的血氧飽和度逐漸下降，PO2，pH值明顯降低，PCO2值明顯升高，呼吸暫停次數(shù)逐漸增大，這些特征和人OSA的發(fā)展過程一致。尤其是反復(fù)麻醉和插管并未造成呼吸道的明顯感染，實(shí)驗(yàn)結(jié)束動(dòng)物清醒后覓食及反應(yīng)良好，動(dòng)脈抽血血?dú)饧邦i靜脈穿刺插管電生理檢查后無明顯出血，無感染。說明模型造模成功，慢性模型穩(wěn)定，設(shè)施相對(duì)簡單，便于研究開展實(shí)施。

根據(jù)已有的文獻(xiàn)尚無統(tǒng)一的OSA動(dòng)物模型，以往曾有報(bào)道通過低壓氧艙造缺氧動(dòng)物模型[18]，或?qū)?dòng)物放入密閉容器中，通過持續(xù)間歇給予低氧，低通氣[19-20]，模擬OSA患者的低氧血癥，但其需要高壓氧倉設(shè)備及較難反應(yīng)正常環(huán)境中缺氧情況，且無法模擬OSA狀態(tài)下反復(fù)缺氧-復(fù)氧狀態(tài)。有學(xué)者通過氣管切開造口并設(shè)置氣管內(nèi)活瓣[14]，規(guī)律打開關(guān)閉氣道造模，但其阻塞部位在環(huán)狀軟骨之下的氣管而非上氣道，而OSA 發(fā)病機(jī)制中的重要機(jī)制是上氣道狹窄。而適用于電生理研究的動(dòng)物模型研究較少，我們已完成了兔急性呼吸暫停模型誘發(fā)房顫的實(shí)驗(yàn)研究，另外學(xué)者們進(jìn)行過犬呼吸暫停模型對(duì)犬電生理及心功能的影響的相關(guān)研究[21-22]，均有模型穩(wěn)定，重復(fù)性好的特點(diǎn)。通過我們的實(shí)驗(yàn)方法可構(gòu)建穩(wěn)定的慢性O(shè)SA伴發(fā)房顫犬動(dòng)物模型，對(duì)犬損傷小，設(shè)備相對(duì)簡單，可重復(fù)性好，為OSA相關(guān)病理生理學(xué)研究及OSA相關(guān)房顫的病理生理機(jī)制研究及可能的治療策略提供了可靠的模型。

3.3模型的局限性本模型為OSA的進(jìn)一步電生理、病理生理、藥理研究提供了一個(gè)穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，但具體的機(jī)制研究尚欠缺。此外，本模型是一種麻醉狀態(tài)下的模型，且白天OSA而夜晚自主呼吸，與臨床OSA患者仍有一定差距。