李文輝 呂博文 錢 鈞 蘇麗菊 楊桐樹 錢景榮 王 杰

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在女性癌癥相關死亡原因中位居第四。由于缺乏有效的早期篩查手段，早期癥狀及臨床表現(xiàn)不典型，約85%的患者初診時已屬疾病晚期錯過手術治療的最佳時期。最新統(tǒng)計資料顯示[1-3]，近10年來，卵巢癌患者死亡率仍然較高，5年生存率沒有明顯改善。上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)是卵巢癌中最常見也是死亡率最高的病理類型，其死亡率高于其他各類婦科腫瘤之和[4-5]。截止目前，上皮性卵巢癌發(fā)生進展中的分子機制仍不完全清楚，給卵巢腫瘤的早期診斷帶來困難和挑戰(zhàn)。因此，尋找與上皮性卵巢癌發(fā)生及進展相關的關鍵因子，對提高上皮性卵巢癌患者生存率至關重要。

MicroRNA(miRNA)是新發(fā)現(xiàn)的一類長度為19～25個核苷酸的小的非編碼RNA，其通過與目標信使RNA(mRNA)3′UTR區(qū)不完全結合，在轉錄后水平調控基因表達[6-7]。miRNA參與調控機體多種生理和病理過程。越來越多的證據(jù)表明，它們與腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移有著密切的關系。一些miRNA，如miR-455、miR-494、miR-520b，可作為癌基因或抑癌基因在上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-150在上皮性卵巢癌組織中存在差異表達，可能是潛在的調控分子[11]，但miR-150對上皮性卵巢癌細胞增殖、凋亡和侵襲轉移能力的影響目前尚不清楚。本研究擬采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)方法檢測miR-150在正常卵巢上皮細胞和上皮性卵巢癌細胞中的表達差異及其對上皮性卵巢癌細胞增殖、凋亡和侵襲轉移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

細胞總RNA提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；Quant一步法逆轉錄熒光定量試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；MTT試劑盒購自美國Promega公司；流式細胞術所用FITC標記的Annexin V-PE/7-AAD雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BioLegend公司；Transwell實驗相關試劑購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；人正常卵巢上皮細胞系T29胞、上皮性卵巢癌細胞系A2780和OVCAR3細胞均購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉染及分組 人正常卵巢細胞(T29)和上皮性卵巢癌細胞(A2780，OVCAR3)置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當上皮性卵巢癌細胞密度達到約70%后，將miR-150無義序列(miR-150NC)和miR-150類似物(miR-150mimic)經(jīng)LipofectamineTM2000轉入細胞中，具體操作步驟參見脂質體2000(LipofectamineTM2000)試劑說明。將細胞分為3組：Blank組(空白對照組)、miR-150 NC組(轉染miR-150NC細胞組)及miR-150 mimic組(轉染miR-150 mimic細胞組)。

1.2.2 qRT-PCR實驗 按照細胞總RNA提取試劑盒說明書所述方法提取各實驗組細胞，然后采用Quant一步法逆轉錄-熒光定量試劑盒所述方法行qRT-PCR，具體步驟如下：按說明書所述依次加入試劑后行一步法qRT-PCR。qRT-PCR反應條件為：50℃ 30 min，95℃ 2 min，35個循環(huán)94℃ 20 s，60℃20 s，65℃ 20 s。

1.2.3 MTT實驗 細胞轉染48 h后，取對數(shù)生長期的上皮性卵巢癌細胞，制備單細胞懸液，以5.0×103個/孔細胞密度接種于96孔板，設置miR-150 mimic組、miR-150 NC組、Blank組三組，每組設8個復孔。分別培養(yǎng)1～3 d，每孔加入20 μL濃度為1.5 mg/mL的MTT，培養(yǎng)4 h后每孔加入150 μL DMSO，讀取吸光度值，繪制細胞生長曲線。

1.2.4 流式細胞術實驗 取轉染48 h后的各組細胞，5 mL PBS洗滌，1000 r/min離心5 min，5 mL PBS洗滌3次后，棄上清液；加入100 μL流式洗液，F(xiàn)ITC標記的Annexin-V和7-AAD各10 μL及同型對照抗體，避光反應10 min后，加入400 μL流式洗液，200目尼龍膜過濾細胞后立即用流式細胞儀上機檢測。細胞凋亡數(shù)據(jù)后期采用Flowjo7.2軟件進行分析。

1.2.5 Transwell實驗 收集培養(yǎng)的各組細胞，以2×108個細胞接種于Matrigel膠包被的Transwell小室，37℃培養(yǎng)24 h。取出小室，去除濾膜上室面的細胞和Matrigel膠，將細胞與1%多聚甲醛混合固定后染色，用顯微鏡計數(shù)進入膜下的細胞數(shù)，進行統(tǒng)計分析。實驗重復3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 上皮性卵巢癌細胞和正常卵巢上皮細胞中miR-150的表達差異

qRT-PCR結果顯示，上皮性卵巢癌細胞系A2780和OVCAR3中miR-150的表達量分別為(A2780：0.41±0.05；OVCAR3：0.34±0.07)，明顯低于正常卵巢上皮細胞系T29(1.79±0.23)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖1)。

2.2 miR-150 mimic上調上皮性卵巢癌細胞中miR-150的表達

在轉染48 h后，qRT-PCR結果顯示miR-150 mimic組 miR-150 的相對表達量明顯高于Blank組和miR-150 NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且miR-150 NC組與Blank組之間miR-150相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，結果提示轉染miR-150 mimic可上調上皮性卵巢癌細胞中 miR-150 的表達水平(圖2)。

圖1 正常人卵巢上皮細胞T29和上皮性卵巢癌細胞A2780、OVCAR3中miR-150的相對表達水平Figure 1 The expression of miR-150 in human ovarian epithelial T29 cells and epithelial ovarian cancer(A2780 and OVCAR3)cellsNote：**P<0.01，compared with the T29 cells group.

圖2 細胞轉染后miR-150的相對表達水Figure 2 The expression of miR-150 in A2780 and OVCAR3 cells after miR-150 mimic transfectionNote：**P<0.01，compared with the Blank and miR-150 NC groups.

2.3 miR-150對上皮性卵巢癌細胞增殖的影響

為研究miR-150對上皮性卵巢癌細胞增殖能力的影響，利用MTT實驗檢測各處理組細胞的增殖差異。結果顯示，miR-150 mimic組細胞OD值在各時間點均較miR-150 NC組及Blank組降低，轉染后第三天，miR-150 mimic組OD值(A2780：1.12±0.03；OVCAR3：1.91±0.03)明顯低于Blank組(A2780：2.35±0.09；OVCAR3：2.63±0.07)和miR-150 NC組(A2780：2.18±0.07；OVCAR3：2.43±0.11)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Blank組與miR-150 NC組OD值相比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果提示，提高上皮性卵巢癌細胞中miR-150的表達可抑制上皮性卵巢癌細胞的增殖(圖3)。

2.4 miR-150對上皮性卵巢癌細胞凋亡的影響

為研究miR-150對上皮性卵巢癌細胞凋亡水平的影響，利用流式細胞術檢測各處理組細胞的凋亡情況的差異。結果顯示，miR-150 mimic組細胞凋亡率(A2780：16.10±0.58%；OVCAR3：15.16±1.30%)明顯高于Blank組(A2780：10.07±0.66%；OVCAR3：3.81±0.24%)和miR-150 NC組(A2780：10.36±1.08%；OVCAR3：4.89±0.07%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Blank組與miR-150 NC組凋亡率相比較差異無統(tǒng)計學意義。結果提示，上調上皮性卵巢癌細胞中miR-150的表達水平可促進上皮性卵巢癌細胞的凋亡，進一步證實miR-150是潛在的腫瘤抑制分子(圖4)。

2.5 miR-150對上皮性卵巢癌細胞侵襲轉移能力的影響

為研究miR-150對上皮性卵巢癌細胞侵襲轉移能力的影響，利用Transwell實驗檢測各處理組細胞侵襲轉移能力的差異。結果顯示，miR-150 mimic組穿膜細胞數(shù)(A2780：38.67±2.03；OVCAR3：28.67±2.03個)，明顯低于Blank組(A2780：76.30±7.45；OVCAR 3：55.67±3.18個)和miR-150 NC組(A2780：74.33±5.78；OVCAR3：56.33±3.84個)，差異有統(tǒng)計學意義(A2780：F=14.49，P<0.01；OVCAR3：F=25.77，P<0.01)；Blank組與miR-150 NC組穿膜細胞數(shù)相比較差異無統(tǒng)計學意義。結果提示，上調上皮性卵巢癌細胞中miR-150的表達水平可抑制上皮性卵巢癌細胞的侵襲轉移能力(圖5)。

圖3 miR-150表達水平對上皮性卵巢癌細胞增殖的影響Figure 3 Effects of miR-150 expression on the proliferation of epithelial ovarian cancer cellsNote：A.The proliferation of A2780 cell；B.The proliferation of OVCAR3 cell；*P<0.01，compared with the Blank and miR-150 NC groups.

圖4 miR-150表達水平對上皮性卵巢癌細胞凋亡的影響Figure 4 Effects of miR-150 expression on apoptosis of epithelial ovarian cancer cellsNote：**P<0.01，compared with the Blank and miR-150 NC groups.

圖5 miR-150表達水平對上皮性卵巢癌細胞侵襲轉移的影響Figure 5 Effects of miR-150 expression on invasion and metastasis of epithelial ovarian cancer cellsNote：**P<0.01，compared with the Blank and miR-150 NC groups.

3 討論

上皮性卵巢癌因其惡性程度高、缺乏有效早期檢查手段，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已處于疾病晚期，且5年生存率低，已經(jīng)成為困擾婦科腫瘤治療的主要問題之一。目前越來越多的證據(jù)顯示，上皮性卵巢癌中存在多種差異表達的miRNA，這些差異表達的miRNA通過調節(jié)相應靶蛋白的表達參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其中包括細胞增殖、凋亡及侵襲轉移等過程[12-13]。因此，揭示上皮性卵巢癌中miRNA的作用及機制對克服這種致命疾病至關重要。

以往研究發(fā)現(xiàn)，miR-150在多種腫瘤中差異表達，通過參與腫瘤細胞多種生物學過程，影響腫瘤的發(fā)展。在甲狀腺癌中，miR-150通過抑制RAB11A/WNT/β-連環(huán)蛋白途徑在體內(nèi)外抑制腫瘤生長[14]；在結腸癌中，miR-150通過靶向調節(jié)MUC4抑制結腸癌細胞的侵襲轉移[15]；在原發(fā)性肝癌中，低水平的miR-150與肝癌患者預后較差顯著相關[16]；在肺癌中高表達的miR-150抑制S激酶信號抑制劑1的表達，使得肺癌細胞增殖轉移增加[17]；在宮頸癌中，miR-150通過靶向FOXO4促進癌細胞的生長[18]。

目前，miR-150在上皮性卵巢癌中的表達及功能研究較少。有研究顯示，在上皮性卵巢癌組織中，miR-150表達水平較正常卵巢上皮組織降低[19]，但其對上皮性卵巢癌細胞生物學活性影響研究尚未見報道。本研究采用qRT-PCR、MTT、流式細胞技術、Transwell等方法，研究miR-150對上皮性卵巢癌細胞生物學活性的影響。與以往研究相符，miR-150在上皮性卵巢癌中表達下降；此外，上調miR-150表達后，通過觀察上皮性卵巢癌細胞增殖、凋亡及轉移侵襲能力我們發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌細胞增殖減少，凋亡增加，轉移侵襲能力明顯下降。由此我們推測：miR-150表達減少可能是上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的機制之一；miR-150可作為抑癌基因，調控上皮性卵巢癌細胞增殖、凋亡及轉移侵襲能力。

本研究目前僅在細胞水平驗證了miR-150對上皮性卵巢癌細胞的抑制作用，下一步，我們將進行miR-150靶蛋白的驗證，明確miR-150水平與上皮性卵巢癌患者臨床進展及預后的關系；未來我們還將著重進行上皮性卵巢癌中miR-150失調機制的探討。miR-150及其靶蛋白的相關研究有望為上皮性卵巢癌早期診斷、預后評估及臨床治療提供新的靶點。