劉雅菁 劉國(guó)鈺 王樹(shù)濱 方征宇

黑色素瘤是黑色素細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化形成的惡性腫瘤，多發(fā)生于皮膚[1-2]，是發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一，年增長(zhǎng)率為3%～5%[3]。因其惡性程度極高，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，早期診斷、早期治療非常重要[4-5]。在過(guò)去三年中，針對(duì)黑色素瘤的靶向治療和免疫治療發(fā)展迅速，致死率降低[6]。但黑色素瘤細(xì)胞極易產(chǎn)生耐藥性[7]，進(jìn)而影響治療效果，出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，成為目前黑色素瘤治療應(yīng)用中十分棘手的問(wèn)題。因此，亟需發(fā)現(xiàn)治療黑色素瘤的新型藥物或輔助藥物。文獻(xiàn)報(bào)道鹽霉素能夠特異性殺傷乳腺癌干細(xì)胞[8]，且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有殺傷作用[9-13]。但在黑色素瘤中的研究非常之少，對(duì)其機(jī)制的研究也尚無(wú)報(bào)道。本文選取人黑色素瘤經(jīng)典細(xì)胞株M21細(xì)胞，檢測(cè)鹽霉素對(duì)其增殖的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

人黑色素瘤M21細(xì)胞株(廣州吉妮歐生物科技公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗(100 mg/mL鏈霉素、100 mg/mL青霉素)(美國(guó)GIBCO公司)；鹽霉素(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；DMSO(美國(guó)Sigma公司)；MTS液(美國(guó)Promega公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS蛋白裂解液、蛋白Marker(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔源LC3B抗體、兔源p62抗體、兔源B2M抗體、鼠抗兔二抗、鼠抗兔熒光二抗(美國(guó)CST公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人黑色素瘤M21細(xì)胞株采用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞放置于37℃，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞后進(jìn)行傳代，實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞株對(duì)鹽霉素敏感性實(shí)驗(yàn)

將人黑色素瘤M21細(xì)胞接種到96孔板中，每孔3000個(gè)細(xì)胞，接種24 h后分別給予濃度梯度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0 μM的鹽霉素，每種濃度設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。藥物作用72 h后，加入MTS工作液20 μL，37℃孵育1 h，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(OD)值。細(xì)胞生存率=(OD加藥組-OD空白)/(OD對(duì)照組-OD空白)×100%，利用細(xì)胞生存率計(jì)算半數(shù)抑制濃度(Half inhibitory concentration，IC50)。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將M21細(xì)胞接種于6孔板中，貼壁后加入1.0 μM鹽霉素處理細(xì)胞。在藥物處理0 h、12 h、24 h、48 h后收集細(xì)胞。用不含EDTA的胰酶消化后用PBS清洗兩次，收集細(xì)胞。按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)標(biāo)記細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)情況

收集1.0 μM鹽霉素分別作用0 h、12 h、24 h、48 h后的M21細(xì)胞，加入適量的蛋白裂解液，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)不同濃度進(jìn)行定量，蛋白上樣10%聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用3%BSA溶液于常溫下封閉30 min，分別加入稀釋過(guò)的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h，洗滌后加入顯影劑并通過(guò)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.6 透射電鏡樣品的準(zhǔn)備與前固定

M21細(xì)胞經(jīng)1.0 μM鹽霉素作用0 h、48 h后，用PBS洗滌細(xì)胞，將細(xì)胞刮下收集到離心管中。立即加入2.5%電鏡用戊二醛0.5 mL固定，勿吹懸，室溫固定1 h，4℃固定3 h，去除戊二醛加滿PBS放置4℃待送檢。將樣品送至廣州南方醫(yī)科大學(xué)電鏡室，經(jīng)過(guò)脫水、浸透、包埋聚合、切片、染色等步驟，在透射電鏡下觀察。

1.7 免疫熒光觀察p62蛋白的表達(dá)和定位

接種適量M21細(xì)胞到細(xì)胞爬片，貼壁后加入1.0 μM鹽霉素分別作用0 h、48 h。室溫PBS清洗后，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，可在搖床上輕搖。加入封閉液(10%山羊血清+0.1% Triton-X100+PBS)，封閉30 min。加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。PBS搖蕩沖洗3次，每次10 min。加入熒光二抗，室溫孵育2 h。PBS清洗后，加入1×DAPI，室溫染色5 min，用雙蒸水清洗一次。晾干封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)和分布情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 鹽霉素對(duì)人黑色素瘤M21細(xì)胞增殖的影響

MTS檢測(cè)結(jié)果顯示，鹽霉素對(duì)人黑色素瘤M21細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，在一定范圍內(nèi)細(xì)胞生存率隨鹽霉素濃度的增加而降低(P<0.05)。人黑色素瘤M21細(xì)胞對(duì)鹽霉素極其敏感，IC50值僅為(1.38±0.18)μM(圖1)。

2.2 鹽霉素對(duì)人黑色素瘤M21細(xì)胞形態(tài)的影響

光學(xué)顯微鏡下觀察1.0 μM鹽霉素處理人黑色素瘤M21細(xì)胞不同時(shí)間后細(xì)胞的形態(tài)變化。正常M21細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，分裂速度非?？?，形態(tài)規(guī)則呈多邊形。給藥后，細(xì)胞分裂增殖速度減慢，形態(tài)變得不規(guī)則，繼而變圓脫落，細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量空泡樣結(jié)構(gòu)形成，空泡會(huì)逐漸變多且變大(圖2)。

2.3 鹽霉素對(duì)人黑色素瘤M21細(xì)胞凋亡的影響

為了研究鹽霉素對(duì)M21細(xì)胞凋亡的影響，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)鹽霉素分別作用0 h、12 h、24 h、48 h后細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果可見(jiàn)隨作用時(shí)間增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量先增加后些許降低，但占總細(xì)胞數(shù)的百分比均較低，表明鹽霉素僅能促進(jìn)少量M21細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡并不是鹽霉素引起大量M21細(xì)胞死亡的主要作用機(jī)制(圖3)。

圖3 流式檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)鹽霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況Figure 3 Salinomycin induced cell apoptosis in M21 cells at different time pointsNote：*P<0.05，**P<0.01，vs. the control group.

圖2 1.0 μM鹽霉素作用M21細(xì)胞不同時(shí)間后細(xì)胞形態(tài)圖(×200)Figure 2 The effect of salinomycin(1.0 μM)on morphological changes of M21 cells

2.4 鹽霉素對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá)的影響

考慮到鹽霉素作用后細(xì)胞內(nèi)有空泡產(chǎn)生，猜測(cè)死亡機(jī)制可能與自噬有關(guān)。于是檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá)。與對(duì)照組相比，加藥組LC3B-Ⅰ蛋白表達(dá)水平隨處理時(shí)間增加而降低。LC3B-Ⅱ蛋白在給藥12 h時(shí)表達(dá)水平略有降低，之后逐漸增加。同時(shí)LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值也隨處理時(shí)間增加而明顯增加。與對(duì)照組相比，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 1.0 μM鹽霉素作用后M21細(xì)胞內(nèi)LC3B蛋白表達(dá)水平Figure 4 The expression of LC3B in M21 cells after treated with 1.0 μM salinomycinNote：*P<0.05，**P<0.01，vs. the control group.

2.5 鹽霉素對(duì)人黑色素瘤M21細(xì)胞自噬的影響

在電鏡下直接看到自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)是檢測(cè)自噬發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)[14]。圖5中可看到1.0 μM鹽霉素處理48 h后M21細(xì)胞內(nèi)形成了許多自噬小體(特征為具有雙層或多層膜結(jié)構(gòu)，其內(nèi)包含細(xì)胞器和胞漿成分)，且出現(xiàn)大面積的空泡化。各結(jié)構(gòu)放大圖見(jiàn)圖5右側(cè)。

圖5 電鏡下觀察1.0 M鹽霉素對(duì)M21細(xì)胞自噬的影響Figure 5 The effect of salinomycin on autophagy in M21 cells

2.6 鹽霉素對(duì)自噬特異性底物p62蛋白的影響

p62蛋白水平變化可以指示自噬流變化情況。由圖6A可以看出，隨著1.0 μM鹽霉素作用時(shí)間增加，p62蛋白水平也有些許增加。為進(jìn)一步驗(yàn)證p62蛋白的變化情況，進(jìn)行了免疫熒光檢測(cè)。由圖6B所示，鹽霉素作用后p62蛋白水平升高且逐漸在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集呈團(tuán)狀。

圖6 1.0 M鹽霉素對(duì)自噬特異性底物p62蛋白表達(dá)水平及定位的影響Figure 6 The expression level and localization of p62 protein in M21 cells treated with salinomycinNote：*P<0.05，**P<0.01，vs. the control group.

3 討論

已有研究結(jié)果顯示鹽霉素不僅能對(duì)乳腺癌干細(xì)胞有特異性殺傷作用[8]，且對(duì)卵巢癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的殺傷作用[9-13]。但其殺傷腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制各不相同[15]，已發(fā)現(xiàn)鹽霉素能夠通過(guò)抑制Akt/NF-κB信號(hào)通路、升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[9-10]，能夠通過(guò)ROS-AMPK-mTOR途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬[11-12]，還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死[13]。但目前還未見(jiàn)有關(guān)于鹽霉素作用于黑色素瘤的具體機(jī)制研究。

在本課題的研究中，我們發(fā)現(xiàn)鹽霉素對(duì)人黑色素瘤M21細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，IC50值僅為(1.38±0.18)μM。同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著1.0 μM鹽霉素作用時(shí)間增加，細(xì)胞不僅增殖速度變慢，而且胞內(nèi)產(chǎn)生了空泡樣結(jié)構(gòu)，逐漸增多變大。因此猜測(cè)鹽霉素抑制人黑色素瘤M21細(xì)胞增殖的作用機(jī)制可能與自噬有關(guān)。

有文章報(bào)道鹽霉素可以誘導(dǎo)某些細(xì)胞發(fā)生自噬，起到促進(jìn)生存的作用，并減弱凋亡過(guò)程[16]。而一些研究發(fā)現(xiàn)鹽霉素能夠誘導(dǎo)異常自噬流，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡的相關(guān)通路[17]。于是我們檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白LC3B的水平變化，發(fā)現(xiàn)鹽霉素可以誘導(dǎo)LC3B-Ⅱ蛋白水平和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值的升高，即自噬小體的增多。因?yàn)樵陔婄R下直接看到自噬小體是檢測(cè)自噬發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)，所以我們進(jìn)行了電鏡檢測(cè)，進(jìn)一步確證了自噬小體的存在，同時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬小體增多繼而導(dǎo)致堆積。

但自噬小體的增多可能歸結(jié)于兩種截然不同的因素，一是自噬流的增加，自噬小體增多最終會(huì)被溶酶體降解，二是自噬小體無(wú)法被降解，導(dǎo)致自噬小體越積越多[18]。同時(shí)有研究結(jié)果顯示，在某些細(xì)胞中鹽霉素能夠引起自噬產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度自噬[19]，而其他研究中發(fā)現(xiàn)鹽霉素能夠抑制自噬流，導(dǎo)致自噬小體堆積無(wú)法降解而引起細(xì)胞死亡[10-11]。在本研究中p62蛋白作為自噬特異性底物[20]，不僅其表達(dá)水平隨時(shí)間增加且在自噬小體中逐漸聚集呈團(tuán)狀，表明自噬小體未被溶酶體降解，細(xì)胞內(nèi)自噬流被抑制，從而導(dǎo)致自噬小體在細(xì)胞內(nèi)堆積，最終引起細(xì)胞死亡。

綜上所述，鹽霉素具有抑制人黑色素瘤M21細(xì)胞增殖的作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)自噬小體增多、抑制細(xì)胞內(nèi)自噬流有關(guān)，但具體分子機(jī)制需進(jìn)一步進(jìn)行研究。本研究結(jié)果為鹽霉素在黑色素瘤中的作用機(jī)制增添了新的研究結(jié)果，為鹽霉素的進(jìn)一步研究與臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，具有臨床應(yīng)用潛力。