林榮杰 尹 航 周云峰

乳腺癌的發(fā)病率已經(jīng)位居我國(guó)城鄉(xiāng)女性惡性腫瘤的首位，是危及女性生命健康最主要的惡性腫瘤之一，并呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)[1]。約75%的乳腺癌患者為激素受體陽性(HR+)的乳腺癌，內(nèi)分泌治療為此類患者提供了重要幫助，然而內(nèi)分泌藥物耐藥是HR+乳腺癌治療面臨的最大挑戰(zhàn)[2-3]。雖然CDK4/6抑制劑Palbociclib能夠有效克服內(nèi)分泌耐藥，但仍然存在原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥問題(耐藥率分別約16%和約50%)[4]。其機(jī)制可能與其脫靶有關(guān)，脫靶問題也成為目前制約激酶抑制劑應(yīng)用的最主要原因之一[5]。因此，設(shè)計(jì)更高效的針對(duì)CDK4的抑制劑從而避免其脫靶現(xiàn)象是亟待解決的問題。

ON123300是一種新型的以CDK4/6為主要靶點(diǎn)的多靶點(diǎn)激酶抑制劑，有研究報(bào)道其在多發(fā)性骨髓瘤、套細(xì)胞淋巴瘤及腦部腫瘤都呈現(xiàn)很好的療效，相比于一代Palbocilib效果優(yōu)勢(shì)明顯[6-8]。但ON123300在乳腺癌中的作用效果尚無報(bào)道。本研究旨在探討其對(duì)ER+，HER2-的乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖、周期、凋亡等影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物與試劑

MCF-7細(xì)胞購于中科院上海生物細(xì)胞所；ON123300(S8161)購于上海藍(lán)木化工有限公司；Palbocilib(PD0332991)購于Med Chem Express(MCE)公司；CCK-8試劑盒(c 6005)購于蘇州宇恒生物科技有限公司；Propidium iodide(PI)(P4170)購于Sigma公司；核糖核酸酶A(RNase A)(R4875)購于Sigma公司；細(xì)胞凋亡試劑盒(F6012)購于蘇州宇恒生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的小牛血清及100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約5×103個(gè)細(xì)胞于100 μL培養(yǎng)基中孵育過夜后加藥，DMSO對(duì)照組分別給予0 μM、2 μM、4 μM、6 μM、8 μM、10 μM的ON123300或Palbocilib處理，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔；于培養(yǎng)箱中孵育48 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔吸光度(OD)值并計(jì)算不同濃度藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率。計(jì)算公式：細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡 收集加藥后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞，PBS重懸潤(rùn)洗2次；離心去上清，100 μL PBS重懸細(xì)胞，緩慢加入700 μL預(yù)冷的80%乙醇，使乙醇終濃度為70%；4℃固定4 h以上；1 000 rpm，5 min，預(yù)冷PBS潤(rùn)洗2次；加入100 μL RNase A(50 μg/mL)，37℃孵育30 min；加400 μL PI(50 μg/mL)，4℃避光染色30 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。按細(xì)胞凋亡試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟操作后于FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡。CytExpert軟件分析細(xì)胞周期及凋亡情況。

1.2.4 Western blot 收集DMSO對(duì)照組、ON123300低濃度處理組(0.5 μM)和ON123300高濃度處理組(5.0 μM)細(xì)胞，提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加熱變性后上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，4℃一抗孵育過夜，二抗室溫孵育一小時(shí)后ECL顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ON123300及Palbocilib對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

光學(xué)顯微鏡下可見，DMSO對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)、增殖迅速，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；ON123300加藥組較對(duì)照組及同濃度Palbocilib加藥組出現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖抑制，細(xì)胞明顯回縮脫落，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差，并且呈現(xiàn)劑量依賴現(xiàn)象，ON123300劑量越高，MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)越差(圖1)。

2.2 ON123300及Palbocilib對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制的影響

與DMSO對(duì)照組相比，ON123300及Palbocilib對(duì)MCF-7的增殖抑制率隨濃度增高而增大(P<0.05)，同濃度的ON123300較Palbocilib對(duì)MCF-7的增殖抑制作用更強(qiáng)(P<0.05)。ON123300作用于MCF-7細(xì)胞的IC50為3.51 μM，而Palbocilib作用于MCF-7細(xì)胞的IC50為7.96 μM(圖2)。

ON123300會(huì)引起MCF-7細(xì)胞周期阻滯，與DMSO對(duì)照組相比，ON1233300處理組的MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)明顯的G1/S期阻滯，G1期明顯延長(zhǎng)，S期明顯縮短，對(duì)比組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖1 各組MCF-7細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變情況Figure 1 The morphological changes of MCF-7 cells in each groupNote：A.The cells in the control group；B.The cells were treated with 0.5 μM Palbocilib for 48 h；C.The cells were treated with 5.0 μM Palbocilib for 48 h；D.The cells were treated with 0.5 μM ON123300 for 48 h；and E.The cells were treated with 5.0 μM ON123300 for 48 h.

圖2 Palbocilib和ON123300對(duì)細(xì)胞增殖率的影響Figure 2 The proliferating rates of MCF-7 cells treated with palbocilib or ON123300

圖5 ON123300對(duì)survivin/cyclinD1/CDK4/Rb和PI3K的蛋白表達(dá)的影響Figure 5 The expression of survivin/cyclinD1/CDK4/Rb and PI3K protein in MCF-7 cells treated with different concentrations of ON123300

圖3 ON123300對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響Figure 3 The distribution of cell cycle in MCF-7 cells treated with ON123300Note：A.The cells in the control group；B.The cells were treated with 0.5 μM of ON123300 for 48 h；and C.The cells were treated with 5.0 μM of ON123300 for 48 h.

2.3 ON123300促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡

與DMSO對(duì)照組相比，ON123300低濃度組(0.5 μM)和高濃度組(5.0 μM)均出現(xiàn)明顯凋亡，且以高劑量組更顯著，對(duì)比組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.05)(圖4)。

2.4 ON123300對(duì)MCF-7細(xì)胞的影響機(jī)制

與DMSO對(duì)照組相比，ON123300處理組的survivin、cyclinD1、CDK4、pRbs807/811及PI3K的蛋白表達(dá)量均明顯降低，對(duì)比組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況Figure 4 The apoptosis of MCF-7 cells treated with ON123300 by flow cytometryNote：A.The cells in the control group；B.The cells were treated with 0.5 μM of ON123300 for 48 h；C.The cells were treated with 5.0 μM of ON123300 for 48 h；and D.The apoptosis of MCF-7 cells treated with ON123300.

3 討論

乳腺癌已成為我國(guó)女性第一大高發(fā)惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性的生命健康[9-10]。其中ER+、HER2-的乳腺癌患者約占3/4，內(nèi)分泌治療耐藥成為影響此類患者生存獲益的主要瓶頸之一。目前，以Palbocilib為代表的細(xì)胞周期依賴性激酶CDK4/6抑制劑已被FDA批準(zhǔn)聯(lián)合內(nèi)分泌治療用于ER+、HER2-的乳腺癌患者治療[11]，但是CDK4/6抑制劑在臨床應(yīng)用中存在脫靶及耐藥問題限制其應(yīng)用[4]。分析主要原因可能為目前使用的CDK4/6抑制劑的效價(jià)并不高，另外在乳腺癌中存在其他參與細(xì)胞周期信號(hào)通路的持續(xù)激活如PI3K信號(hào)通路，細(xì)胞周期抑制劑P21和P27同時(shí)受其調(diào)控，從而參與調(diào)控細(xì)胞周期[4]。因此，與CDK4/6單靶點(diǎn)抑制劑相比，高效抑制CDK4/6且同時(shí)抑制PI3K激酶的藥物可能具有較好的療效。

ON123300是一種高效的基于CDK4/6的多靶點(diǎn)激酶抑制劑，體外Kinase assay實(shí)驗(yàn)顯示其抑制CDK4/cyclinD1的IC50為3.87 nM[12]。在套細(xì)胞淋巴瘤中，ON123300通過雙重抑制CDK4/Rb和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路不僅引起細(xì)胞周期阻滯，高濃度明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而一代的CDK4/6抑制劑Palbocilib并不能促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與Palbocilib相比，ON123300對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有更強(qiáng)的增殖抑制作用，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的脫落。ON123300引起MCF-7細(xì)胞明顯的G1/S期阻滯，并伴有嚴(yán)重凋亡。有研究表明，survivin與CDK4結(jié)合形成survivin/CDK4復(fù)合物，競(jìng)爭(zhēng)性地使P16與CDK4分離，將CDK4運(yùn)送至細(xì)胞核后被cyclinD1/CDK4復(fù)合物取代，引起Rb磷酸化進(jìn)而使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期[13-15]。本研究Western blot結(jié)果顯示ON123300不僅明顯抑制MCF-7細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞周期起重要調(diào)控作用的survivin/cyclinD1/CDK4/Rb信號(hào)通路，同時(shí)抑制了乳腺癌中調(diào)控細(xì)胞周期的PI3K信號(hào)通路，因此較Palbocilib這類特異性的CDK4/6抑制劑，ON123300不僅對(duì)CDK4/cyclinD1靶點(diǎn)有更強(qiáng)的抑制作用，而且可以有效抑制PI3K激酶，從而阻滯雙重周期相關(guān)通路。因此ON123300既避免了Palbocilib等一代CDK4/6抑制劑因效價(jià)不高而出現(xiàn)的脫靶現(xiàn)象，又避免了單靶點(diǎn)抑制劑對(duì)細(xì)胞周期通路抑制的不充分性。

綜上所述，ON123300通過雙重高效抑制CDK4和PI3K激酶靶點(diǎn)，繼而抑制survivin/cyclinD1/CDK4/Rb和PI3K信號(hào)通路，對(duì)ER+、HER2-的乳腺癌細(xì)胞具有明顯增殖抑制，促進(jìn)G1/S期細(xì)胞阻滯和細(xì)胞凋亡的作用。與一代Palbocilib相比，具有明顯的殺傷優(yōu)勢(shì)。ON123300有望成為治療ER+、HER2-乳腺癌患者的有效藥物，其臨床應(yīng)用效果和價(jià)值需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。