楊清 杜進璇 姜孝芳 高麗 馬冬均

近年支氣管哮喘的發(fā)病機制研究取得一定的進展，這些研究成果賦予了支氣管哮喘的臨床應用前景，但仍有許多問題有待于進一步闡明。除外環(huán)境因素，越來越多的遺傳學研究在基因水平證實支氣管哮喘存在有遺傳傾向。支氣管哮喘是一種多基因疾病，發(fā)病機制復雜，臨床表型又有明顯的異質(zhì)性。有研究表明T-bet、GATA-3轉(zhuǎn)錄因子與Th細胞分化有關(guān)[1-2]，而其在支氣管哮喘發(fā)病機制中表現(xiàn)了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。通過T-bet、GATA-3基因的SYBR Green I實時熒光定量PCR方法，探討支氣管哮喘患者與健康對照中的失衡表達，以及這種失衡表達對支氣管哮喘的影響[3]。

1 資料及方法

1.1 臨床資料

所有支氣管哮喘患者及健康對照者均經(jīng)簽署知情同意書后抽取靜脈血5 ml，收集支氣管哮喘和健康對照各100例；抽取外周血標本，樣本取自新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院呼吸科門診及住院患者；同期健康志愿者。其中男性支氣管哮喘患者52例，女性支氣管哮喘患者48例，年齡18～55歲，平均年齡(26.24±6.82)歲，男性健康對照54例，女性健康對照46例，年齡18～62歲，平均年齡(26.33±5.85)歲，兩組基本資料差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。支氣管哮喘診斷標準參照文獻[4]。

1.2 標本采集及實驗方法

外周血中的CD4+T淋巴細胞用免疫磁珠法分離獲?。籆D4+T淋巴細胞T-bet mRNA、GATA-3mRNA表達，檢測采用SYBR Green I熒光定量PCR方法。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析處理，數(shù)據(jù)采用正態(tài)性檢驗，計量資料用(±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基因組RNA電泳圖譜

支氣管哮喘組和健康對照組CD4+T淋巴細胞，用免疫磁珠法分離獲得，并用Trzol法提取基因組RNA。見圖 1。

圖1 瓊脂糖凝膠支氣管哮喘組和健康對照組CD4+T細胞總RNA電泳圖

2.2 T-bet、GATA-3 mRNA 的表達

支氣管哮喘組100例和健康對照組100例，通過實時熒光定量RT-PCR 檢測，相對定量法算出T-bet、GATA-3和GAPDH mRNA表達含量相對比值，結(jié)果如圖所示，支氣管哮喘組及健康對照組T-bet mRNA、GATA-3 mRNA 和GAPDH的曲線，線條均勻，表明擴增穩(wěn)定。從結(jié)果中可見支氣管哮喘哮喘組GATA-3基因mRNA表達水平高于健康對照組，支氣管哮喘組與健康對照組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；支氣管哮喘組T-bet mRNA表達含量高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表 1。

表1 支氣管哮喘組和對照組中T-bet、GATA-3的相對表達量

3 討論

支氣管哮喘發(fā)病的機制復雜，而T細胞亞群分化，尤其是Th1/Th2失衡與相關(guān)細胞因子的相互作用，也已證實其在哮喘發(fā)病機制中扮演關(guān)鍵角色，豐富了其在支氣管哮喘的療效評價和預后判斷中的臨床應用前景。遺傳學研究在基因水平已證實變應性疾病的遺傳傾向。支氣管哮喘是一種多基因疾病，哮喘患者表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄因子T-bet 和GATA-3 調(diào)控失衡。Th2 細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA是能促進Th2 細胞的分化及相關(guān)細胞因子的表達。多數(shù)的研究表明哮喘患者的呼吸道或者PBMC 中GATA-3 的表達增加；Th2細胞中GATA-3特異性表達,是Th2 型細胞因子轉(zhuǎn)錄必需,GATA-3可同時抑制各種Th2 前炎性因子的表達[5]。而T-bet轉(zhuǎn)錄因子作為特異性調(diào)控Th1分化起Th1/Th2轉(zhuǎn)換開關(guān)作用。T-bet主要在Th1中細胞表達, IFN-γ的分泌和Th1細胞的發(fā)育均受其影響。在調(diào)控Th細胞分化失衡中有重要意義[6-7]。

多數(shù)研究認為，作為體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)細胞Thl/Th2細胞亞群是體內(nèi)起著免疫平衡關(guān)鍵作用的細胞， Thl和Th2細胞相互作用，從而調(diào)節(jié)Thl/Th2細胞平衡[8]。驅(qū)動T細胞和B細胞增殖，增加巨噬細胞的產(chǎn)生是在細胞因子IL-2刺激作用下Thl細胞分化完成；而巨噬細胞是在細胞因子IFN-γ和LT等刺激下使其分泌其他細胞因子，從而其吞噬作用增強，促進巨噬細胞活化，完成細胞免疫，發(fā)揮調(diào)節(jié)抗炎、抗感染免疫功能作用[9]。對于IL-13、IL-10、IL-5、IL-4等細胞因子多由Th2細胞產(chǎn)生，介導體液免疫完成，進而導致變態(tài)反應發(fā)生；而分泌的IL-13、IL-4可影響Thl型細胞因子IFN-γ分泌減少，進而維持Th2細胞亞群形成，促進Th2細胞亞群功能優(yōu)勢，隨著Th2細胞亞群功能持續(xù)作用， Th1細胞亞群功能會逐漸削弱。而由Thl細胞分泌的細胞因子IFN-r同樣會抑制Th2細胞的分化和功能；自身免疫性疾病和炎癥應答的發(fā)生機制中，不同Th細胞亞群的作用會不同，甚至完全相反[10]。不斷活化的CD4+Th2細胞亞群可激活抗凋亡蛋白Bal抑制Fas誘導的凋亡，從而產(chǎn)生CD4+記憶性細胞，調(diào)節(jié)免疫細胞群體向Th2細胞亞群偏移[11-12]。

前期的實驗中，對于Th1和Th2的關(guān)鍵細胞因子IL-4、IFN-γ基因甲基化研究，初步探索了甲基化在Th1/Th2失衡中的意義，表明Th1/Th2失衡可影響支氣管哮喘發(fā)作。此次實驗對Th1和Th2標志性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3，半定量分析支氣管哮喘組和健康對照組基因表達的水平。支氣管哮喘組中轉(zhuǎn)錄因子GATA-3mRNA高表達，而轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA低表達，但主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 mRNA表達增強，使Th2類細胞因子如:IL-4、IL-5等分泌增多，而Th1類細胞因子比如:IL-2、IFN-γ等含量減少，從而導致支氣管哮喘發(fā)作時的臨床表現(xiàn)。此次實驗對支氣管哮喘組和健康對照組進行檢測轉(zhuǎn)錄因子T-bet、 GATA-3mRNA相對表達水平，支氣管哮喘組GATA-3基因mRNA表達水平高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；而支氣管哮喘組與健康對照組T-bet mRNA表達水平無明顯差異。作為Th1細胞及Th2細胞的重要轉(zhuǎn)錄因子，二者的平衡打破會導致Th1/Th2細胞失衡。表明T-bet/GATA-3表達比例失衡是支氣管哮喘發(fā)病中的關(guān)鍵因素，故糾正調(diào)節(jié)二者的比例失衡；可能有助于治療支氣管哮喘。

因此在人群中進行大規(guī)模的T-bet 基因的篩查及基因多態(tài)性分析, 有助于闡明哮喘發(fā)病和T-bet 缺陷有關(guān)的證據(jù)。顯然, 本組研究的樣本量是遠遠不夠的, 僅僅是進一步工作的初探。故擴大病例樣本量，繼續(xù)進行實時熒光定量檢測，結(jié)合定性研究將會對T-bet/GATA-3在支氣管哮喘發(fā)病中作用有更深入的了解。