（浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江杭州 311199）

液相芯片技術(shù)（Multi-analyte profiling，solve for unknown x，xMAP technology），是20世紀(jì)90年代中期美國 Luminex公司開發(fā)出的被喻為后基因組時代的芯片技術(shù)。它以微球體代替細(xì)胞作為反應(yīng)載體，可進行蛋白、核酸等生物大分子的檢測，不僅從細(xì)胞水平深入到分子水平，其檢測范圍也得到前所未有的擴展。現(xiàn)就液相芯片的技術(shù)原理、特點及其在動物病原微生物檢測方面的應(yīng)用做一綜述。

1 基本原理

1995年，美國Luminex公司將流式細(xì)胞儀、數(shù)字信號處理器和一種激光檢測裝置相結(jié)合，開發(fā)了一種具有多指標(biāo)同步分析（xMAP）功能的芯片技術(shù)，也稱為液態(tài)芯片（Liquid chip）或懸浮芯片（Suspension array）?；驹硎牵?/p>

xMAP技術(shù)以流式細(xì)胞儀為檢測平臺，用許多大小均一穩(wěn)定的微球為載體，微球內(nèi)部含有三種熒光免疫熒光，通過熒光不同的比例可以區(qū)分500種不同的微球，每種微球可以用來檢測一種不同的蛋白或基因。該技術(shù)利用熒光編碼的微球共價交聯(lián)單克隆抗體，與被測定的目標(biāo)分子結(jié)合后，加入熒光素標(biāo)記的檢測抗體，再通過激光掃描熒光編碼來識別單個微球和測量“檢測熒光”強度來確定被測分子的濃度。所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)計算機處理后，用配套軟件分析即可直接用來判斷結(jié)果。

2 液相芯片的特點

2.1 高通量、速度快

可在同一反應(yīng)體系中放入不同編碼的微球，每種微球?qū)?yīng)一種檢測物質(zhì)。利用Luminex公司開發(fā)的3色熒光編碼技術(shù)，10μl微量標(biāo)本可檢測多達(dá)500個指標(biāo)，提高了標(biāo)本的利用率，實現(xiàn)了樣品的高通量檢測。整個雜交反應(yīng)在液相環(huán)境中進行，使得雜交反應(yīng)動力學(xué)顯著加快，效率顯著提升，大大地縮短了雜交時間，最快可達(dá)10 000測試/h。

2.2 特異性好，靈敏度高

微球的表面積大，先通過特異性的PCR將靶分子數(shù)量擴大，再通過特異性的探針與目標(biāo)分子雜交，每個微球能結(jié)合約（1～2）×106個探針分子，反應(yīng)時熒光信號強；兩束不同激光分別檢測微球上的分類熒光信號和報告基團上的熒光信號，兩種信號同時存在時才可以檢測分析。微球表面還可以進行化學(xué)處理，進一步地提高反應(yīng)的特異性。

2.3 應(yīng)用范圍廣、重復(fù)性好

在微球表面上包被不同的抗原、抗體、細(xì)胞因子、核酸等生物分子，便可檢測相應(yīng)的目標(biāo)物；可以應(yīng)用商品化檢測試劑盒或者根據(jù)檢測物質(zhì)的不同特點，利用分子雜交原理自行設(shè)計方案。液相芯片技術(shù)相比于以往固相芯片技術(shù)，降低了固相芯片在大分子檢測時受空間效應(yīng)、表面張力等很多反應(yīng)動力學(xué)的干擾，并且增加了檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，提高了檢測樣品的重復(fù)性。檢測的重復(fù)性可以達(dá)至90%以上，線性范圍寬，動態(tài)范圍可達(dá)4～6 個數(shù)量級。

2.4 操作簡便、經(jīng)濟實惠

應(yīng)用液相芯片一次檢測就能完成多份樣品多個指標(biāo)同時檢測，節(jié)約了試劑，耗材及勞動力，降低了樣品檢測的成本，提高了分析的效率，液態(tài)芯片在大大提高檢測效率的基礎(chǔ)上，檢測試劑比用其他方法檢測相同指標(biāo)時價格更實惠。檢測儀器和消耗品相對固相芯片技術(shù)也便宜。

3 液相芯片在動物病原微生物檢測中應(yīng)用

3.1 液相核酸芯片

朱海紅等（2007）基于懸浮芯片技術(shù)建立的狂犬病毒等56種病原微生物的高通量檢測微生物診斷技術(shù)平臺，高通量、快速、可靠且經(jīng)濟，為突發(fā)傳染病的病原體診斷提供技術(shù)儲備。詹愛軍等（2010）建立了可以同時檢測鹿流行性出血熱病毒、阿卡斑病毒、藍(lán)舌病病毒和水泡性口炎病毒等4 種蟲媒病的快速高通量液相芯片技術(shù)，這四種蟲媒病是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的法定報告動物疫病和我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定的一、二類動物傳染病，為防止此類疾病進入我國以及監(jiān)控其在我國的流行提供了重要的技術(shù)儲備。張曉娜等（2012）成功建立了檢測H5、H7、H9禽流感，新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒等6種病毒的液相芯片檢測方法，敏感性、特異性和穩(wěn)定性均較好。王晶鈺等（2012）成功建立了PPV、PCV2 二重xMAP檢測方法，該方法與標(biāo)準(zhǔn) PCR檢測符合率為100%，該檢測技術(shù)可用于出入境檢疫和獸醫(yī)臨床檢驗。王政等（2017）建立蝦桃拉病毒、黃頭病毒和白斑病毒檢測方法，檢測靈敏度高分別為401.5、251.5和75.2 copies。除了檢測病毒，近年來也有學(xué)者采用液相基因芯片進行細(xì)菌、真菌等臨床鑒定。

3.2 液相蛋白芯片

盧愛桃等（2008）建立了一種可以同時檢測猴T淋巴細(xì)胞白血病毒I型、猴單純皰疹病毒兩種病毒抗體的液相芯片技術(shù)，對比ELISA與流式熒光微球檢測結(jié)果，證明用熒光微球?qū)镅暹M行檢測，不僅比ELISA法快速省時，而且靈敏度比間接ELISA法高出～100倍。劉志玲等（2012）用xMAP蛋白芯片技術(shù)建立牛地方流行性白血病的檢測方法，實驗結(jié)果顯示對牛白血病病毒抗體的檢測敏感性可達(dá)119.7 ng/μl；批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均小于10%，試驗重復(fù)性良好；所制備的偶聯(lián)微球芯片保存3個月，其檢測結(jié)果無顯著差異，穩(wěn)定性好。蔡月琴等（2013）應(yīng)用制備的兔IgG、IgM和IgA液相芯片建立的xMAP方法，對實驗兔血清進行檢測，檢測結(jié)果與ELISA結(jié)果一致，提示該方法可應(yīng)用于實驗兔血清的IgG、IgM和IgA半定量檢測。

4 液相芯片的應(yīng)用前景

液相芯片技術(shù)可用于多種生物分子（核酸和蛋白質(zhì)）檢測，但是這項技術(shù)仍存在著一些難點和缺陷，如不同探針間溫度的差異、檢測血清中特異性抗體時檢測的背景值高對實驗造成干擾等。我們可以相信，隨著研究的不斷進展和深入，這些缺陷會很好的得到解決，今后這一技術(shù)會成為臨床診斷、基礎(chǔ)研究、新藥開發(fā)、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、生物武器防范等領(lǐng)域一項重要的分析檢測技術(shù)，將大大推動生命科學(xué)的研究與發(fā)展。