茍　青，陶　玲，李曉莉，宋超峰，彭　亮，代梨梨，李　谷

(1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

胞外酶(extracellular enzyme)是指細(xì)胞內(nèi)合成穿過細(xì)胞膜并在細(xì)胞外發(fā)揮作用，使多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等高聚物裂解變?yōu)榭纱┻^細(xì)胞質(zhì)膜而被吸收利用的小分子物質(zhì)的一類酶[1]。水體中的溶解有機(jī)碳大多以高聚物的形式存在，不能被細(xì)菌等異養(yǎng)微生物直接利用，只有通過胞外酶的水解作用，把這些高聚物分解為小分子單體或低聚物才能被微生物利用[2]。這一關(guān)鍵的生化過程，改變了有機(jī)物的組成和可利用性，是調(diào)節(jié)水體有機(jī)營養(yǎng)平衡的重要生態(tài)因子，也是眾多異養(yǎng)微生物賴以生存的基礎(chǔ)。因此，水中胞外酶活性不僅可以反映水環(huán)境中有機(jī)物的數(shù)量和質(zhì)量，還能反映浮游生物對(duì)有機(jī)組分的改造程度及該有機(jī)物組分對(duì)浮游生物生長繁殖的營養(yǎng)貢獻(xiàn)[3]。水環(huán)境中的胞外酶進(jìn)行著物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和元素的循環(huán)，并促使能量的流動(dòng)，調(diào)控著整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能。另外，胞外酶活性的變化及其分布特征可反映微生物活性及水環(huán)境營養(yǎng)狀況。Kiersztyn等[4]提出了酶TSI指標(biāo)來評(píng)價(jià)水環(huán)境的營養(yǎng)狀況，并證明該指標(biāo)在水體質(zhì)量監(jiān)測中非常有效。

水中胞外酶活性特征指標(biāo)還可以早期預(yù)警水環(huán)境脅迫[5]。養(yǎng)蝦池塘水中低蛋白酶活性與高生產(chǎn)力相關(guān)，水中高水平的蛋白酶活性和幾丁質(zhì)酶活性指示水質(zhì)惡化和環(huán)境脅迫[6]。但目前對(duì)淡水養(yǎng)殖池塘水中胞外酶活性特征的研究還鮮見報(bào)道。本研究運(yùn)用熒光模擬底物法對(duì)養(yǎng)殖池塘水體中的堿性磷酸酶(AP)、β-葡萄糖苷酶(BG)、亮氨酸氨肽酶(LAP)以及脂肪酶(LIP)活性隨養(yǎng)殖進(jìn)程的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測，分析精養(yǎng)池塘水中胞外酶活性在不同粒徑生物上的分布，并研究池塘水中各酶活性與水質(zhì)理化因子之間的相關(guān)性，以全面了解養(yǎng)殖池塘中物質(zhì)循環(huán)以及評(píng)估養(yǎng)殖水體環(huán)境質(zhì)量和生態(tài)效率，為池塘水質(zhì)監(jiān)測和調(diào)控提供基礎(chǔ)性資料和科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所窯灣實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)在4口大小完全一樣的養(yǎng)殖池塘中進(jìn)行，池塘面積667 m2，水深1.5 m。池塘主養(yǎng)草魚，放養(yǎng)規(guī)格100 g/尾，平均放養(yǎng)密度為1 000尾/667 m2，配養(yǎng)鰱規(guī)格為300 g/尾，鳙規(guī)格為150 g/尾。

1.2　采集與分析

1.2.1水質(zhì)指標(biāo)

1.2.2胞外酶活性

同時(shí)采集水樣裝入滅菌玻璃瓶用于酶活性測定，水樣分別用3 μm和0.22 μm的濾膜逐級(jí)過濾，以區(qū)分不同粒徑來源的胞外酶活性，將胞外酶的來源分為：>3 μm粒徑浮游生物酶活性，0.22～3 μm粒徑浮游生物酶活性，<0.22 μm的浮游生物酶活性。

酶活性的測定采用熒光模擬底物法(FMS)[8]，向待測水樣中加入相應(yīng)的酶底物，在模擬現(xiàn)場溫度，避光條件下與酶反應(yīng)3 h，在反應(yīng)結(jié)束后加入HgCl2阻止反應(yīng)，并迅速冷凍保存，空白樣在取水樣后直接加入HgCl2阻止反應(yīng)，冷凍保存。測試前逐步解凍恢復(fù)至室溫，用熒光分光光度計(jì)測定樣品熒光強(qiáng)度。β-葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶和脂肪酶使用4-甲基傘形酮(MUF)為底物，反應(yīng)生成4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷、4-甲基傘形酮酰磷酸酯和4-甲基傘形酮油酸酯，MUF的激發(fā)和發(fā)射波長分別是365 nm和455 nm。亮氨酸氨肽酶使用7-氨基-4甲基香豆素(AMC)為底物，反應(yīng)生成L-亮氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素鹽酸鹽，AMC的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是380 nm和440 nm。以酶水解底物釋放出顯色熒光團(tuán)(MUF或AMC)的速率來表示胞外酶活性。

1.2.3細(xì)菌總數(shù)

細(xì)菌總數(shù)采用平板涂布計(jì)數(shù)法，將處理好的水樣進(jìn)行稀釋，分別取合適稀釋度的0.1 mL稀釋液涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)。

1.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

胞外酶活性與環(huán)境因子的相關(guān)分析在SPSS 20.0中進(jìn)行，用Pearson 檢驗(yàn)方法(檢驗(yàn)水平為P<0.05和P<0.01)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)間的相關(guān)水平，主成分分析用Canoco for windows 4.5完成，用Origin 2015軟件繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　池塘水質(zhì)理化因子動(dòng)態(tài)變化特征

池塘水體的理化指標(biāo)如圖1所示。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，池塘水溫平均值為25.7 ℃，水溫的變化與氣溫保持一致，8月份最高為31.9 ℃，10月份最低為18.5 ℃。pH的變化范圍是6.8～8.1，且各月份的差異不大。DO隨著時(shí)間的變化先下降，在8月份的時(shí)候降到最低，后期略微上升。池塘水體透明度前期5-8月較高，后期9-10月份較低。

圖1　池塘水質(zhì)理化因子的季節(jié)變化Fig.1　Seasonal variation of physicochemical parameters in ponds

2.2　池塘水中胞外酶活性動(dòng)態(tài)變化特征

由圖2可以看出，池塘水中胞外酶活性均較高，總β-葡萄糖苷酶活性變化范圍為0.18～1.63 μmol/(L·h)，總堿性磷酸酶活性變化范圍為0.96～3.49 μmol /(L·h)，總脂肪酶活性變化范圍為1.48～2.68 μmol/(L·h)，總亮氨酸氨肽酶活性變化范圍為0.28～1.66μmol/(L·h)?？偊?葡萄糖苷酶活性隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長而升高，在8月份達(dá)到最高值(1.63 μmol/(L·h))后9月份下降，在10月份又升高至1.63 μmol/(L·h)。總堿性磷酸酶的活性在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)處于較高水平，隨后下降再上升，在8月份達(dá)到另一個(gè)小高峰(3.5 μmol/(L·h))，之后則開始下降?？傊久富钚宰兓厔菖c堿性磷酸酶一致，先下降再升高再下降，不同的是，最低點(diǎn)(1.61 μmol/(L·h))出現(xiàn)在7月份，再次升高的最高點(diǎn)(2.15 μmol/(L·h))在9月份，但是比5月份(2.68 μmol/(L·h))的酶活性低?？偭涟彼岚彪拿富钚栽?-9月呈逐漸增加的趨勢(從0.29 μmol/(L·h)到1.69 μmol/(L·h))，10月份有所下降(0.93 μmol/(L·h))。

圖2　池塘水中胞外酶的動(dòng)態(tài)變化Fig.2　Dynamics of extracellular enzymes in the pond water

為研究池塘水中胞外酶活性動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)，對(duì)胞外酶數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化變換后，應(yīng)用Canoco for Windows 4.5實(shí)施主成分分析。提取了4個(gè)主成分，主成分1(PC1)為65.3%，主成分2(PC2)為20.6%，前兩軸的累積貢獻(xiàn)率為85.9%。從排序圖可以看出，池塘水體胞外酶的月份變化比較明顯，各月份的胞外酶活性在排序圖上很好地分離開來。5月份各樣點(diǎn)分布于第一象限，6月份和7月份位于第四象限，8月份位于第二象限，9月份和10月份位于第三象限。

2.3　不同粒徑胞外酶活性分布

本研究中β-葡萄糖苷酶在養(yǎng)殖水體中的分配比例最高的是>3 μm粒徑浮游生物，其所占比例為70%～78%，其次為<0.22 μm的游離態(tài)，且隨著溫度的升高，游離態(tài)所占的比例增加，最高可達(dá)到51%。堿性磷酸酶活性主要來源為<0.22 μm的游離態(tài)，平均比例占到57.13%，其中，7月高溫季節(jié)，游離態(tài)堿性磷酸酶活性占絕對(duì)優(yōu)勢，達(dá)到79%。脂肪酶活性主要來源于<0.22 μm的游離態(tài)和>3 μm粒徑浮游生物，但不同月份在不同粒徑上的分布有所差別，6-10月，>3 μm粒徑浮游生物來源的脂肪酶活性呈逐漸升高趨勢。>3 μm粒徑浮游生物來源的亮氨酸氨肽酶活性始終處于優(yōu)勢地位，占75.04%～95.37%，其次是0.22～3 μm粒徑來源的亮氨酸氨肽酶占3.96%～12.3%，游離態(tài)的亮氨酸氨肽酶比例最低，而且隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，游離態(tài)亮氨酸氨肽酶活性越低。

圖3　池塘水中胞外酶活性的主成分分析Fig.3　Principal component analysis of extracellular enzyme activities in the pond water

圖4　池塘中不同來源胞外酶活性的百分比圖Fig.4　Percentage of extracellular enzyme activities at various carriers in ponds

2.4　水中胞外酶活性與環(huán)境因子的關(guān)系

3　討論

表1　池塘水中胞外酶活性與水質(zhì)理化因子的相關(guān)性分析Tab.1　Relationship of extracellular enzyme activities and water physical-chemical parameters

注：*表示在0.05水平上顯著相關(guān)；**表示在0.01水平上顯著相關(guān)

淡水養(yǎng)殖池塘中，堿性磷酸酶水解是磷轉(zhuǎn)化再生的重要機(jī)制[17]。堿性磷酸酶能夠酶促磷酸酯水解而釋放出磷酸根，將有機(jī)磷水解為無機(jī)磷，多具有外部功能，其主要作用是向細(xì)胞提供磷營養(yǎng)，它的合成有賴于環(huán)境中磷的營養(yǎng)狀態(tài)，與水體的磷循環(huán)和碳循環(huán)密切相關(guān)[18]。本研究中<0.22 μm的游離態(tài)為堿性磷酸酶主要的來源(57.13%)，在廈門西海域[19]的研究也有相似的結(jié)果。海水中81.2% 堿性磷酸酶活性來自于<0.22 μm粒徑的游離態(tài)[15]。在法國海灣的研究[20]中發(fā)現(xiàn)，堿性磷酸酶的主要來源為0.22～3 μm粒徑(60%)，與本研究有所差異，可能原因是養(yǎng)魚對(duì)水體的溶解態(tài)堿性磷酸酶有重要貢獻(xiàn)[21]，養(yǎng)殖飼料的輸入及魚的糞便增加了底質(zhì)的酶活性，魚的活動(dòng)擾動(dòng)底質(zhì)，從而增加了池塘的自由態(tài)的堿性磷酸酶活性。另外一個(gè)可能的原因是細(xì)胞裂解產(chǎn)生的游離態(tài)堿性磷酸酶在水體中持久時(shí)間更長[22]。

脂肪酶是一種較小的蛋白質(zhì)，是參與脂質(zhì)降解最典型的酶，能夠?qū)⒅舅鉃楦视秃椭舅?，在脂質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中起到主要作用。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，脂肪占所有有機(jī)物的 3%～55%?；畹幕蛩劳龅母∮沃参?、浮游動(dòng)物和大型植物是水體脂肪的主要來源[23]。養(yǎng)殖池塘水中殘餌含有較高的脂肪，這可能是本研究中池塘水中具有較高脂肪酶活性的原因，其最高可達(dá)到2.68 μmol/(L·h)。Gajewski[24]在多瑙河的研究中發(fā)現(xiàn)<0.2 μm粒徑來源的游離態(tài)脂肪酶活性占總脂肪酶活性的20.1%～56.3%，0.2～1 μm粒徑浮游生物來源的脂肪酶活性占21.2%～36%，>1 μm粒徑浮游生物來源的脂肪酶活性占18.2%～58.8%。本研究中脂肪酶的形態(tài)主要為游離態(tài)和>3 μm粒徑浮游生物來源(分別為40.78%和40.04%)，這可能跟不同水體脂肪來源不同有關(guān)，養(yǎng)殖池塘水中細(xì)胞裂解形成的游離態(tài)酶及浮游植物和大顆粒附著態(tài)細(xì)菌來源的脂肪酶占主導(dǎo)，這可能與本研究池塘中浮游植物具有較高的生物量相關(guān)(Chl.a含量為264.6 mg/m3)。同時(shí)，浮游植物死亡之后，脂肪的濃度較高[24]，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)5-9月池塘中浮游植物裂解在水面形成脂質(zhì)油膜，可能增加水中游離態(tài)脂肪酶的活性。

亮氨酸氨肽酶能從N端依次水解L型氨基酸組成的肽和酰肽，將多肽分解為亮氨酸和其他疏水性的氨基酸，從而為異養(yǎng)細(xì)菌的生長提供所需的氮源物質(zhì)，在水環(huán)境中氮元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程中起著非常重要的作用[25]。水體中的肽酶很大程度上依賴于水體中多肽的濃度，當(dāng)水體中的蛋白質(zhì)明顯增加時(shí)，亮氨酸氨肽酶會(huì)迅速的合成[26]。Patel 等[27]報(bào)道亮氨酸氨肽酶活性隨著富營養(yǎng)化程度提高而提高，這解釋了本研究中隨著養(yǎng)殖進(jìn)程池塘水中氮磷等營養(yǎng)水平提高，亮氨酸氨肽酶活性也呈提高的趨勢。Konopka等[2]的研究發(fā)現(xiàn)87%的氨肽酶是附著態(tài)的。法國Aydat湖的研究[28]也表明，大于1 μm的亮氨酸氨肽酶活性占總的亮氨酸氨肽酶酶活性的75.4%，0.2～1 μm的占12.1%，小于0.2 μm的游離態(tài)占12.4%，與本研究的結(jié)果一致，大于3 μm粒徑浮游生物來源的亮氨酸氨肽酶活性比例最高，占75.04%～95.37%。浮游植物同化形成的蛋白質(zhì)能調(diào)控亮氨酸氨肽酶活性，本研究中亮氨酸氨肽酶活性與葉綠素濃度呈正相關(guān)，表明養(yǎng)殖池塘中浮游植物也能對(duì)亮氨酸氨肽酶活性進(jìn)行調(diào)控。另外，亮氨酸氨肽酶活性與DO負(fù)相關(guān)，與其他水質(zhì)因子正相關(guān)，說明含氮有機(jī)物的分解需要消耗大量氧氣，亮氨酸氨肽酶活性越高，分解作用越強(qiáng)，導(dǎo)致的池塘DO水平降低，這可能是亮氨酸氨肽酶活性越高，養(yǎng)殖生產(chǎn)力越低[6]的原因。養(yǎng)殖過程中亮氨酸氨肽酶活性在10月份以前呈逐漸上升趨勢，提示了養(yǎng)殖水質(zhì)有惡化傾向。因此，養(yǎng)殖過程中更應(yīng)該關(guān)注亮氨酸氨肽酶活性。通過亮氨酸氨肽酶活性監(jiān)測淡水養(yǎng)殖池塘水質(zhì)進(jìn)行早期預(yù)警，具可行性。

酶的種類和活性水平的變化反映了環(huán)境的營養(yǎng)狀態(tài)，浮游細(xì)菌可以通過優(yōu)勢種類的變化和相同種類浮游細(xì)菌相關(guān)酶基因表達(dá)量的變化來應(yīng)對(duì)環(huán)境中有機(jī)物濃度和成分變化[29]。胞外酶活性在較短時(shí)間內(nèi)具有動(dòng)態(tài)變化幅度大的特點(diǎn)，可反映浮游細(xì)菌種類和環(huán)境因子的動(dòng)態(tài)變化。因此，本研究通過弄清養(yǎng)殖過程中胞外酶活性動(dòng)態(tài)特征，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中可針對(duì)池塘水中胞外酶活性動(dòng)態(tài)(特別是亮氨酸氨肽酶活性)調(diào)整管理措施，及時(shí)調(diào)節(jié)水體有機(jī)營養(yǎng)平衡。另外，水解酶的活性受到底物種類和濃度的影響，本研究中未測定池塘水中顆粒態(tài)和溶解態(tài)有機(jī)物的濃度，下一步研究中應(yīng)當(dāng)同時(shí)監(jiān)測池塘水中有機(jī)物種類和濃度，結(jié)合胞外酶活性動(dòng)態(tài)，以全面了解池塘生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)。