趙良杰，彭新亮，郭旭升

(信陽農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，河南省漁業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，河南信陽 464000)

微衛(wèi)星，又稱簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)或者短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)[1]，具有高穩(wěn)定性、高多態(tài)性、引物通用性、位點特異性、檢測方便和呈共顯性遺傳等特點[2]，其作為一種良好的分子標(biāo)記，在水產(chǎn)科學(xué)中被廣泛應(yīng)用。近年來，隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，利用二代測序為基礎(chǔ)的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)開發(fā)使得大規(guī)模開發(fā)微衛(wèi)星位點成為可能[3]，基于二代測序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)平臺可以提供大量的微衛(wèi)星位點信息[2]。

銀鲴(Xenocyprisargentea)屬于鯉形目(Cypriniformes)鲴亞科(Xenocyprininae)鲴屬(Xenocypris)，是一種小型淡水經(jīng)濟(jì)魚類，廣泛分布于海南至黑龍江的國內(nèi)各江河、湖泊等水體[4]，是一種重要的淡水漁業(yè)捕撈對象[5]；由于其喜食底棲碎屑和著生藻類等食物，該種常常被作為水庫和池塘中凈化水質(zhì)和優(yōu)化養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)的工具魚[6]。但是，隨著近年來環(huán)境污染、水體富營養(yǎng)化、過度捕撈等原因，銀鲴的野外種群數(shù)量也在快速下降。同時，盡管目前有人工繁殖銀鲴的相關(guān)報道[7,8]，但是該種的遺傳選育工作尚未開展，僅見少量野生群體的遺傳學(xué)研究：肖武漢等[9]采用RFLP技術(shù)對長江和閩江流域的若干群體進(jìn)行遺傳分析；胡玉婷等[10]結(jié)合形態(tài)學(xué)和線粒體CytB基因?qū)蛾柡捌溧徑档你y鲴進(jìn)行了遺傳學(xué)研究；劉軍等[11]采用線粒體COI序列對長江、黑龍江以及錢塘江的銀鲴群體進(jìn)行了研究。目前仍然缺乏對于銀鲴遺傳資源狀況的全面認(rèn)識，開發(fā)大規(guī)模的銀鲴微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記，對于銀鲴遺傳資源的調(diào)查和分子標(biāo)記輔助育種工作的開展具有重要意義。為了更好地保護(hù)和利用這一物種，本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，對銀鲴的微衛(wèi)星位點進(jìn)行開發(fā)和篩選，以期為銀鲴的遺傳資源進(jìn)行開發(fā)利用、銀鲴的分子標(biāo)記輔助育種和種質(zhì)保護(hù)等工作提供技術(shù)支持。

1　材料和方法

1.1　樣品采集與DNA提取

32尾樣品采集自洞庭湖岳陽湖區(qū)，形態(tài)鑒定依據(jù)《中國動物志》[4]，體長為(18.0±4.8) cm，取尾鰭置于95%乙醇中帶回實驗室。取0.1 g尾鰭組織用滅菌雙蒸水洗去乙醇后，置于1.5 mL離心管中剪碎，采用酚/氯仿法提取DNA，后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，模板DNA保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2　轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的微衛(wèi)星挖掘

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集來自于本實驗室自測數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)上傳至NCBI公共數(shù)據(jù)庫，登錄號為SRP102051)，對質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，組裝采用Trinity軟件(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/)完成。采用MISA(Microsatellite identification tool)(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中微衛(wèi)星序列的分析，共鑒定6和類型的微衛(wèi)星序列：Mono-nucleotide(單堿基)，Di-nucleotide(雙堿基)，Tri-nucleotide(三堿基)，Tetra-nucleotide(四堿基)，Penta-nucleotide(五堿基)，Hexa-nucleotide(六堿基)。微衛(wèi)星序列的重復(fù)數(shù)閾值依次設(shè)置為10、6、5、5、5、5。

1.3　引物設(shè)計與合成

本研究選取四堿基，五堿基和六堿基微衛(wèi)星序列，使用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，引物長度在20～23 bp，擴(kuò)增片段長度在100～400 bp之間，共設(shè)計48對引物序列。引物由上海邁浦生物科技有限公司合成。

1.4　PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測

為驗證各引物的擴(kuò)增效果，取4個模板DNA樣品，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測。10 μL PCR反應(yīng)體系包括：10×Easy Taq Buffer 1 μL(20 mmol/L Mg2+)，dNTPs(0.25 mmol/L)1 μL，引物各0.5 μL(μmol/L)， Taq DNA聚合酶1 U，模板DNA約為2 ng。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性60 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5　微衛(wèi)星位點分析和多態(tài)性驗證

根據(jù)PCR檢測結(jié)果，取上述32個樣品的模板DNA，對能夠成功擴(kuò)增的引物經(jīng)上海邁浦生物科技有限公司熒光標(biāo)記后，加入分子量內(nèi)標(biāo)，利用ABI 3730XL 分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型。結(jié)合Genemapper 4.0進(jìn)行DNA片段長度分析。確定具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點。

1.6　數(shù)據(jù)分析

對上述獲得的多態(tài)性位點進(jìn)行種群遺傳參數(shù)的統(tǒng)計。利用PopGene32軟件計算每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)Na(allele number)，觀測雜合度Ho(observed heterozygosity)，期望雜合度He(expected heterozygosity)，香農(nóng)-威爾指數(shù)H(Shannon-Wiener Index)，同時進(jìn)行哈代-溫伯格平衡HWE(Hardy-Weinberg equilibrium)檢驗。采用PIC_CALC 軟件計算各個位點的多態(tài)信息含量PIC(polymorphism information content)。

2　結(jié)果

2.1　轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的微衛(wèi)星挖掘

使用MISA軟件對銀鲴肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行微衛(wèi)星數(shù)據(jù)挖掘，結(jié)果如表1所示。根據(jù)重復(fù)單元的類型和重復(fù)次數(shù)，將不同的SSR位點進(jìn)行分類(表1)，其中數(shù)量最多的SSR類型為單核苷酸重復(fù)，比例占全部重復(fù)序列的65.86%，其次是二核苷酸和三核苷酸重復(fù)，比例分別為20.75%和12.39%，四、五、六核苷酸重復(fù)的SSR類型較少，所占比例分別為0.84%、0.10%以及0.07%。

表1　轉(zhuǎn)錄組中SSR標(biāo)記分析結(jié)果Tab.1　Output statistics of SSR makers in transcriptome

2.2　微衛(wèi)星序列的引物設(shè)計和反應(yīng)條件的摸索

本研究中，共選擇了48個微衛(wèi)星位點進(jìn)行引物設(shè)計，48個位點分別包括了40個四堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點，3個五堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點，5個六堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點(48個微衛(wèi)星序列已上傳至NCBI，序列號：MF693180-MF693227)。本實驗設(shè)計的48對引物序列及相關(guān)信息見附表1。參考引物tm值，將PCR反應(yīng)的退火溫度均設(shè)置在55 ℃。對這48對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在105～378 bp之間，除DN24390-p4位點外，其余47個位點均獲得穩(wěn)定點的PCR產(chǎn)物(圖1)。對DN24390-p4進(jìn)行梯度PCR驗證(溫度范圍為50～60 ℃)，仍未得到有效擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1　48對引物擴(kuò)增的PCR驗證結(jié)果Fig.1　PCR amplification results of 48 pairs of primers

2.3　微衛(wèi)星分型和遺傳多態(tài)性分析

從上述可以成功擴(kuò)增的47對引物中選取26個位點對洞庭湖銀鲴群體進(jìn)行分型和遺傳多樣性分析。發(fā)現(xiàn)其中5對引物表現(xiàn)出單態(tài)，21對引物表現(xiàn)出多態(tài)性。呈現(xiàn)多態(tài)性的21個位點的等位基因數(shù)見表2。21個具有多態(tài)性的位點中，四堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點為15個，五堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點為2個，六堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點為4個。

根據(jù)21對多態(tài)性引物在該群體中的分型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，觀測雜合度(Ho)在0.187 5～0.968 8之間，期望雜合度(He)在0.228 7～0.916 2之間，香濃-威爾指數(shù)在0.468 7～2.520 1之間。多態(tài)信息含量(PIC)在0.210 9～0.893 7范圍內(nèi)，其中12個位點PIC值大于0.5，8個位點的PIC值在0.25～0.5之間，1個位點的PIC值小于0.25?？ǚ綑z驗Hardy-Weinberg平衡結(jié)果表明，有6個位點(DN17679-p4，DN21251-p4，DN21454-p5，DN21477-p4，DN23059-p6，DN23506-p5)極顯著偏離(P<0.01)，其余15個位點表現(xiàn)為符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05) (表2)。

圖2　部分微衛(wèi)星位點(位點DN12410-p4)的分型鑒定峰圖Fig.2　The peak figure of partial microsatellite loci (Loci DN12410-p4)

表2　26位點在洞庭湖銀鲴群體的分型情況及其遺傳參數(shù)描述Tab.2　The genetic parameters description of 26 loci in the Dongting Lake population

3　討論

以往的資源調(diào)查和研究顯示[11]，長江流域的銀鲴群體具有最高的種群遺傳多樣性和最廣泛的資源分布，是開展銀鲴遺傳育種理想的種質(zhì)資源庫，其中湖南洞庭湖和江西鄱陽湖是該種種群數(shù)量最為豐富的地區(qū)，長江流域部分繁育場長期將洞庭湖銀鲴群體作為親本開展該種的人工繁育工作。本研究的結(jié)果也再一次證明，洞庭湖群體的銀鲴具有良好的種群遺傳多樣性，適合作為銀鲴遺傳育種的候選群體。

利用二代測序技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，是大規(guī)模開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的良好途徑。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，該方法已經(jīng)成為微衛(wèi)星位點開發(fā)的主流方法之一。目前許多魚類利用該技術(shù)獲取了多態(tài)性良好的微衛(wèi)星序列：蔡磊等[12]對諸氏鯔蝦虎魚轉(zhuǎn)錄組序列中微衛(wèi)星標(biāo)記的初步篩選，55對引物中有32對表現(xiàn)出多態(tài)性；龔詩琦等[13]對黃姑魚轉(zhuǎn)錄組SSR進(jìn)行了開發(fā)驗證，從38對引物中篩選出18對具有多態(tài)性的引物；岳華梅等[3]使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對興國紅鯉的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行了篩選，在20對引物中篩選出9對具有多態(tài)性的引物。上述研究均取得了較好的微衛(wèi)星篩選效果。本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序方法，同樣取得了較好的篩選效果，并從26個成功擴(kuò)增的位點中獲得了21個具有多態(tài)性的位點，多態(tài)微衛(wèi)星位點篩選效率高于上述研究，上述研究微衛(wèi)星篩選所用群體或者是養(yǎng)殖群體(如諸氏鯔蝦虎[12]和興國紅鯉[3])，或者其篩選過程中采用的樣本數(shù)過少(黃姑魚的SSR開發(fā)中僅用兩個野生群體和一個養(yǎng)殖群體的各5個樣本混合進(jìn)行篩選[13])；而本研究中，我們選取洞庭湖野生群體作為轉(zhuǎn)錄組開發(fā)和微衛(wèi)星多態(tài)性篩選的材料，且采用了較大的群體樣本數(shù)(32尾)，因此獲得了更多的多態(tài)性位點。本研究采用了四堿基以上微衛(wèi)星重復(fù)類型的位點作為篩選目標(biāo)。在一些物種例如兩棲有尾目和鱗翅目昆蟲的研究中，由于二堿基位點更容易受到微衛(wèi)星DNA家族的影響，因此其篩選效率要要低于四堿基位點[14,15]。盡管魚類目前尚未見微衛(wèi)星DNA家族的報道，但是考慮到兩堿基重復(fù)的微衛(wèi)星可能處于演化的初期，而四堿基以上重復(fù)的微衛(wèi)星序列則經(jīng)歷了較長的演化歷史，其對于突變的積累更加穩(wěn)定[14]，目前已有一些魚類微衛(wèi)星引物的開發(fā)如紅唇薄鰍[16]、圓口銅魚[17]等采用了四堿基以上的位點。盡管有文獻(xiàn)報道在魚類中二堿基位點具有更好的多態(tài)性和更多的重復(fù)次數(shù)，但在本研究中，我們選取了四堿基，五堿基，六堿基位點依然獲得了很好的多態(tài)性。PIC檢測表明，26個驗證位點中，具有多態(tài)性的位點有21個，占80.7%；其中高度多態(tài)位點(1>PIC>0.5)為12個，中度多態(tài)位點(0.5>PIC>0.25)8個，僅有1個位點為低度多態(tài)位點(PIC<0.25)。重復(fù)次數(shù)上，本研究的四堿基以上重復(fù)位點均在10次以下，紅唇薄鰍、中國明對蝦和圓口銅魚四堿基和五堿基重復(fù)也以10次以下的居多[16-18]，本研究的結(jié)果與其他的研究結(jié)果一致。另外，在具有多態(tài)性的21個微衛(wèi)星位點中，有6個顯著偏離哈代-溫伯格平衡(HWE)。這些哈溫平衡偏離可能是由自然選擇、基因突變或者遺傳漂變等因素造成[3]。

本研究對于引物設(shè)計的成功率進(jìn)行了探討，首先轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和微衛(wèi)星開發(fā)采用的樣本都來自洞庭湖，避免了種群遺傳差異帶來的引物設(shè)計失??；其次，通過引物設(shè)計位置的選擇和同源比對，可以使得引物的設(shè)計成功率大大提升。本研究中，在48對引物中，有47對設(shè)計引物都成功獲得了微衛(wèi)星序列擴(kuò)增產(chǎn)物，引物設(shè)計成功率為97.9%。另外，有報道認(rèn)為四堿基以上重復(fù)位點可能具有比二堿基位點具有更好的側(cè)翼序列保守性[14]，這也是本研究引物設(shè)計成功率高的可能原因，但在魚類中，這一問題尚需要進(jìn)一步探討。