邱文娜 吳宏斌 方朝東 王永智 熊吉濱

江蘇省泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心，江蘇泰州 225300

艾塞那肽（Exendin-4）是合成肽類，具有腸促胰島素分泌激素（Incretin）類似物效應(yīng)。該產(chǎn)品首次由美國Amylin制藥公司開發(fā)合成，主要用于控制血糖，改善胰島素抵抗[1-3]。目前該藥品無其他公司生產(chǎn)，且無藥典收藏質(zhì)量標準，本實驗室利用基因工程技術(shù)，經(jīng)過純化、濃縮、凍干等工藝，得到重組艾塞那肽。蛋白含量是該產(chǎn)品質(zhì)量控制的一項重要內(nèi)容，本實驗室依據(jù)中國藥典2015年版三部/四部通則0731 第二法，經(jīng)過方法學驗證，建立了本產(chǎn)品蛋白含量測定的方法[4-8]。

不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，測量結(jié)果的表述需同時包含被測量值及與該值相關(guān)的測量不確定度[9-11]，本文依據(jù)《測量不確定度評定和表示》、《檢測和校準實驗室能力的通用要求》中的有關(guān)規(guī)定，參考已發(fā)表文章的方法[12-13]，對艾塞那肽蛋白含量測定的不確定度進行分析[12-17]，以期望找到影響其不確定度的各種因素，為客觀評價艾塞那肽蛋白含量的檢驗結(jié)果提供科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 樣品

艾塞那肽由本實驗室提供，樣品約2mg/支。

1.2 主要試劑及儀器

堿性銅溶液（國藥集團化學試劑有限公司，臨用前配制）；牛血清白蛋白（中國食品藥品檢定研究所，批號為 140619-201622）；酚試劑（2N，Sigma101308200）；水為超純水，其他試劑為分析純；電子天平 Sartorius BSA224S-CW；紫外分光光度計Thermo Biomate3s。

2 檢測方法

2.1 酚試劑準備

用移液管取2N 酚試劑10mL置棕色瓶中，并加入10mL水配制成1N濃度酚試劑。

2.2 標準蛋白質(zhì)溶液制備

精確稱取0.1g牛血清白蛋白，加100mL水定量稀釋至1mg/mL作為貯備液；用移液管精密量取貯備液2.5mL置25mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即為100μg/mL的標準蛋白質(zhì)溶液。

2.3 樣品制備

精密稱取樣品約2mg至試管中，加入2mL水使溶解，混勻，并取50μL稀釋至250μL作為供試品進行檢測。

2.4 標準曲線的制作及供試品濃度的測定

預先打開紫外分光光度計，選好程序（Lowry法，波長650nm，標準樣品數(shù)為5，對應(yīng)濃度依次輸入 20，40，60，80，100μg/mL，并選擇 Linear選項）。

精密量取標準蛋白溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別于試管中，加水至1mL（并以1mL水作空白對照），加堿性銅溶液5mL，搖勻，室溫放置10min，快速加入酚試劑0.5mL，搖勻，室溫放置30min顯色；同時，分別取50μL供試品于不同的3個試管內(nèi)作為3次重復，其它操作同標準蛋白溶液。

顯色后，以標準品的蛋白質(zhì)濃度對應(yīng)其吸光度作直線回歸，求得直線回歸方程，并將供試品溶液吸光度代入直線回歸方程，計算供試品蛋白質(zhì)濃度，及樣品蛋白含量。

3 不確定度來源分析

根據(jù)標準曲線及儀器直接測定出的OD值所計算得到的結(jié)果為稀釋后溶液中的蛋白含量，通過式（1）根據(jù)稱取樣品的質(zhì)量、樣品溶液體積和稀釋倍數(shù)可計算出樣品的蛋白含量：

其中c為稀釋后供試品中蛋白濃度；a為稀釋倍數(shù)；V為樣品溶液體積；m為樣品的總質(zhì)量，mg。

根據(jù)數(shù)學模型，不確定度的來源主要來自：（1）蛋白濃度的測定；（2）供試品稀釋；（3）加樣體積；（4）樣品稱量。

4 各分量不確定度的評定

4.1 供試品蛋白濃度測定的相對不確定度

供試品濃度測定的不確定度主要來源于方法重復性和標準品溶液。

4.1.1 供試品測定重復性的相對不確定度urelx1

表1 標準樣品濃度與所測OD值

供試品蛋白吸光度值共重復三次測量（結(jié)果為 0.109、0.111、0.108），將測定的供試品 OD 值代入標準曲線線性方程，得到稀釋后的供試品蛋白濃度 C樣品分別為 40.46、41.23、40.08μg/mL，平均值 C樣品為40.6μg/mL；計算原樣品中蛋白含量平均值為40.6×5=203μg/mL。

采用A類不確定度評定方法計算供試品測定重復性的不確定度分量（n=3），根據(jù)貝塞爾公式計算

4.1.2 標準品溶液的相對不確定度urelx2

（1）標準品純度的相對不確定度urel（p）

牛血清白蛋白標準品由中國食品藥品檢定研究所提供，標識蛋白含量為23.5mg，未給出純度和限度標識，參照基準物質(zhì)的含量，假定其含量為（23.5±0.05）%[5]，視為矩形分布（包含因子K=），則由此帶來的不確定度為：

相對不確定度為：

（2）標準品稱量帶來的不確定度

標準品稱量不確定度來自天平稱量重復性和天平校準兩個方面：

天平稱量重復性的不確定度，所用電子天平（d=0.01mg）天平檢定證書列出的重復性誤差為±0.05mg，屬B類不確定度，按矩形分布（包含因子K=），天平稱量重復性的不確定度為u1(m)=0.0289。

天平校準產(chǎn)生的不確定度，所用電子天平（d=0.01mg）的檢定證書給出的最大允差為±0.03 mg，屬 B 類不確定度，按矩形分布（包含因子K=），天平校準產(chǎn)生的不確定度為：

因此，單次稱量的標準不確定度為：u(mi)=0.0337，標準品稱量帶來的相對不確定度為（標準品的稱樣量為101.5mg）：

（3）標準溶液稀釋過程帶來的不確定度

該項不確定度包括玻璃量器體積檢定的不確定度和溫度引起的不確定度。

本實驗室所用的A級5mL單標移液管，經(jīng)查檢定證書：容量允差為±0.015mL，按矩形分布（包含因子K=），則由移液管帶來的不確定度分量為：

本實驗室所用的A級25、100mL容量瓶，經(jīng)查檢定證書：容量允差分別為±0.030mL、±0.10mL，按三角分布（包含因子K=），則由 25、100mL 容量瓶產(chǎn)生的不確定度分量分別為：

因?qū)嶒灜h(huán)境均在空調(diào)下進行，設(shè)定室溫為（20±5）℃，水的膨脹系數(shù)為 2.1×10-4℃，按矩形分布，移液管、容量瓶因環(huán)境溫度引進的不確定度分別為

綜上，由5mL移液管及25、100mL容量瓶帶來的相對不確定度分別為:

則標準溶液稀釋過程帶來的不確定度為：

綜上，標準品溶液的相對不確定度

4.2 供試品稀釋帶來的不確定度urelx3

在實驗過程中，使用200μL移液器移50μL供試品及200μL水進行樣品稀釋。根據(jù)檢定報告200μL移液器允許誤差為±1.5μL，按照矩形分布，本次實驗所帶來的相對不確定度為：

4.3 樣品溶液體積urelx4

樣品溶液體積總共為2mL，1000μL移液器移取2次至樣品瓶中得到，根據(jù)檢定報告1000μL移液器允許誤差為±4.0μL，按照矩形分布，因而帶來樣品體積不確定度為：

4.4 樣品重量urelx5

樣品重量稱量不確定度來自天平稱量重復性和天平校準兩個方面，供試品稱量與標準品稱量為同一天平的同一量程，評定方法相同，樣品重量稱量帶來的相對不確定度為（樣品的稱樣量為2.2mg）：

4.5 合成標準不確定度

相對標準不確定度的平方和進行合成，得到合成相對標準不確定度

4.6 擴展不確定度

取包含因子K=2，置信概率為95%，擴展不確定度為：

4.7 不確定度報告

按照國家標準使用Lowry法測定樣品蛋白含量，平行測試3份取平均值報告結(jié)果為203μg/mg。取包含因子K=2，置信概率為95%時，檢測結(jié)果可表示為蛋白含量X=（203±7.4）μg/mg。

5 討論

5.1 影響蛋白含量測定不確定度的因素

不確定度是指在實驗過程中，由于測量誤差的存在，對被測量值不能確定的程度。凡是在實驗過程中可能造成實驗誤差的因素均可能是不確定度的來源，分析時應(yīng)理清每個不確定度分量的因果關(guān)系，確保無遺漏。本實驗中，不確定度來源主要涉及測量重復性、標準品及樣品的稱量及稀釋、加樣體積。由檢測重復性引入的不確定度屬于A類不確定度，標準品和樣品的稱量及稀釋、加樣體積引入的不確定度屬于B類不確定度。本實驗結(jié)果顯示，樣品稱量引入的不確定度最大，其次為檢測重復性，樣品加樣體積、樣品稀釋及標準品帶來的不確定度較小，標準品溶液引入的不確定度分量中，由標準溶液稀釋引入的不確定度最大。樣品及標準品稱量使用同一臺天平，而樣品稱量引入的不確定度遠遠大于標準品，這與本實驗中樣品質(zhì)量較小有關(guān)。

5.2 減少不確定度對測量結(jié)果影響的策略

為減少不確定度對檢測結(jié)果的影響，檢測過程中需選用與稱量樣品重量精密度相匹配的電子天平，且確保天平在檢定有效期內(nèi)，稱量室應(yīng)在相對獨立的區(qū)域，設(shè)置專用天平臺，以最大程度減小由稱量帶來的誤差。檢測時應(yīng)嚴格遵守標準操作規(guī)程，使用經(jīng)檢定校準合格的移液器、容量瓶、移液管，以降低重復性誤差。

不確定度的評定應(yīng)該是一份完整樣品檢驗報告的一部分，任何檢驗方法都不可避免的有不確定度的引入。不確定度的評價對檢測結(jié)果臨界值的判斷和檢驗方法的確認有十分重要的意義。