郭偉洪 張丹丹 繆卓峰 梁劍平 袁小玲

廣東省中山市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東中山 528400

2014年全球慢性阻塞性肺疾病防治創(chuàng)議（GOLD）及哮喘防治創(chuàng)議（GINA）首次對哮喘-慢性阻塞性肺疾病重疊綜合征（ACOS）的臨床特征進(jìn)行全面綜述，并對其診斷及治療提出建議[1-2]。但目前在臨床上識(shí)別及明確診斷ACOS仍有一定的難度。近年來關(guān)于其流行病學(xué)、病因、臨床特征、病理生理特征、治療方案等研究全面開展[3]。但尚未見到關(guān)于ACOS患者氣道重塑及氣道上皮屏障功能等方面的研究。

氣道重塑在氣道慢性炎癥性疾病發(fā)展中起關(guān)鍵作用，可導(dǎo)致氣道反應(yīng)性增高、肺功能下降、激素抵抗、病情加劇及造成不可逆氣流受限[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，哮喘及COPD患者均存在氣道重塑，但兩者氣道重塑發(fā)生的部位、程度及具體結(jié)構(gòu)變異卻不完全一致[5]。氣道上皮屏障功能主要由氣道上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞間連接蛋白及上皮細(xì)胞與基質(zhì)間連接組成。其功能的破壞直接導(dǎo)致氣道炎癥的發(fā)生。但目前尚未有關(guān)于ACOS及COPD患者氣道屏障功能的報(bào)道[6-7]。

本研究擬通過對比哮喘、COPD及ACOS患者氣道黏膜基底膜厚度、上皮細(xì)胞間E鈣粘蛋白及B-環(huán)連蛋白的分布，初步研究三種疾病狀態(tài)下氣道重塑情況及氣道上皮屏障功能，從病理角度識(shí)別三種疾病的異同，為更好的認(rèn)識(shí)及區(qū)分三種疾病提供進(jìn)一步依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年3月 ～ 2016年3月中山市人民醫(yī)院呼吸科就診的正常組15例、哮喘14例、慢阻肺16例及重疊綜合征14例 。ACOS診斷參考2014年GINA及GOLD聯(lián)合推薦指南[8]，慢阻肺及哮喘的診斷按照2014年版GOLD和GINA指南標(biāo)準(zhǔn)[9]。正常組的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）來院進(jìn)行健康體檢的志愿者；（2）年齡＞20歲；（3）檢查資料齊全。其他三組的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者均處于疾病穩(wěn)定期；（2）3個(gè)月內(nèi)未使用吸入及全身激素；（3）近4周無急性呼吸道感染；（4）所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

免疫組化試劑盒（購自深圳的晶美工程公司）、兔抗人E-cadherin多克隆抗體、兔抗人B-catenin多克隆抗體、抗兔二抗（均購自武漢的博士德生物公司）、肺功能儀（購自日本美能公司的AS-407型）、光學(xué)顯微鏡（購自日本奧林巴斯公司的CX23型）等。

1.3 研究方法

1.3.1 基本資料采集 收集所有受試者的一般資料，包括年齡、吸煙史、過敏史、近6個(gè)月用藥史及行mMRC、CAT等問卷調(diào)查。

1.3.2 肺功能檢查及分組 所有患者完善肺通氣功能、支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn)或支氣管舒張實(shí)驗(yàn)檢查。主要檢查指標(biāo)：FEV1，F(xiàn)VC、FEV1%預(yù)計(jì)值。

1.3.3 纖維支氣管鏡檢查下氣道黏膜活檢 所有患者在氣道局部麻醉或聯(lián)合全身麻醉狀態(tài)下行纖維支氣管鏡檢查。在段級(jí)支氣管開口附近取3 ～ 5塊氣道黏膜。標(biāo)本迅速放入4%福爾馬林中固定，后期行HE染色及免疫組化檢測。

1.3.4 基底膜厚度的測量 固定好的氣道黏膜組織，經(jīng)脫水、包埋、切片、中性樹膠封片后，置光學(xué)顯微鏡下觀察，采用image J（NIH，美國）軟件進(jìn)行基底膜厚度測量。每個(gè)標(biāo)本至少測量3個(gè)不同位置基底膜厚度，最終取平均值。測量方法參考Justyna的方法。

1.3.5 免疫組化 氣道粘膜組織行福爾馬林固定、脫水、包埋、切片、脫蠟、水化。3%H2O2封閉15min，兔抗人E-cadherin多克隆抗體（1∶100）4℃孵化過夜?？雇枚?7℃孵化60min，DAB顯色。蘇木素復(fù)染1min，脫水、封片，倒置相差顯微鏡下觀察拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料作正態(tài)性檢驗(yàn)，如樣本符合正態(tài)分布以（±s）表示；如樣本不符合正態(tài)分布則以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（%）表示。兩組治療前基線的比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)方法，多組間比較采用one-way ANOVA，各組間兩兩比較采用Bonferroni法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者一般情況

健康對照組、哮喘組、慢阻肺組、ACOS組各組間性別、年齡、吸煙史差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但各組間肺功能（FEV1、FEV1/FVC）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見表 1。

2.2 各組氣道基底膜厚度比較

哮 喘 組（47.25±14.38）μm 及 ACOS組（54.75±18.28）μm氣道基底膜厚度較正常組（12.25±3.86）μm明顯增厚（P＜0.05）。COPD組（23±7.87）μm與正常組無顯著差異（P＞0.05）。與COPD組相比，ACOS組基底膜厚度明顯增厚，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與哮喘組相比，ACOS組基底膜厚度有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖 1 ～ 2。

表1 各組間一般資料

圖1 各組患者氣道黏膜基底膜厚度注：光學(xué)顯微鏡×400倍

圖2 各組氣道黏膜基底膜厚度比較（±s）

2.3 氣道上皮細(xì)胞間連接蛋白表達(dá)及分布的異同

各組中，E-鈣粘蛋白 及β-環(huán)連蛋白均主要表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞膜，胞質(zhì)中也有表達(dá)，其中β-catenin亦可見胞核表達(dá)。相對于正常組，哮喘組、COPD組及ACOS組E鈣粘蛋白細(xì)胞膜上的分布減少、排列紊亂，但各組間差異不明顯（圖3）。各組間β環(huán)連蛋白表達(dá)無明顯差異（圖4）。

圖3 各組氣道黏膜E鈣粘蛋白免疫組化

圖4 各組氣道黏膜β環(huán)連蛋白免疫組化

3 討論

哮喘及COPD均屬于慢性氣道炎性疾病，可累及從中央到外周的整個(gè)呼吸道[10]。ACOS作為獨(dú)立于哮喘及COPD的一種疾病，具有自身的特點(diǎn)。本研究從氣道基底膜厚度及氣道上皮間連接蛋白的分布入手，從病理特征上進(jìn)一步認(rèn)識(shí)三種疾病的異同。

本研究發(fā)現(xiàn)，與哮喘及COPD患者相比，ACOS患者氣道基底膜增厚最明顯，提示ACOS患者氣道重塑程度最重。這一發(fā)現(xiàn)從另一個(gè)角度解釋了ACOS患者肺功能更差、FEV1下降速度更快、臨床癥狀更重的原因。目前普遍認(rèn)為，ACOS患者是在患有哮喘基礎(chǔ)上進(jìn)展為COPD，或者在不完全可逆氣流阻塞情況下出現(xiàn)部分可逆性氣流受限，病人在氣道炎癥方面更類似于COPD[11-12]。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ACOS患者氣道基底膜厚度與asthma更類似，COPD患者氣道基底膜增厚相對較輕。提示在氣道重塑方面，ACOS可能與asthma程度更接近。但有關(guān)三種疾病狀態(tài)下氣道重塑的具體差異，尚需更進(jìn)一步的研究證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)ACOS患者BMT厚度較COPD組明顯增厚，可以解釋為何臨床上ACOS患者對糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)較COPD好。該發(fā)現(xiàn)為ACOS患者早期使用表面激素治療提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。E鈣粘蛋白及β-環(huán)連蛋白是組成氣道上皮細(xì)胞間粘附連接及緊密連接的重要分子，參與氣道上皮機(jī)械屏障及炎癥防御功能。既往研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者中存在E鈣粘蛋白、ZO-1等連接蛋白表達(dá)異常，且與氣道炎癥程度有一定相關(guān)性[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)asthma、COPD及ACOS各組中E鈣粘蛋白表達(dá)均存在有分布紊亂及表達(dá)減少，首次證實(shí)了COPD及ACOS患者同樣存在有類似哮喘患者的上皮屏障功能的破壞。該研究結(jié)果提示屏障功能的破壞可能是慢性氣道炎性疾病的共同特征。本研究未發(fā)現(xiàn)三組間E鈣粘蛋白分布及表達(dá)存在顯著差異，不排除與病例數(shù)較少有關(guān)；且受研究條件限制，未同時(shí)行誘導(dǎo)痰及肺泡灌洗液檢查，未能進(jìn)一步研究上皮屏障功能的破壞與炎癥浸潤的關(guān)系。本研究中，各組間上皮細(xì)胞β環(huán)連蛋白表達(dá)無顯著差異，但其在細(xì)胞內(nèi)的分布可能存在不同，在哮喘組存在細(xì)胞核分布增多及分布較彌散的情況，具體的差異尚需進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

總之，asthma、COPD、ACOS患者間氣道基底膜厚度存在明顯差異，提示ACOS組氣道重塑程度最重；各組間E鈣粘蛋白表達(dá)及分布較正常組均有異常。本研究為進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)ACOS及區(qū)別ACOS與asthma及COPD提供了新的途徑。但仍需大樣本的研究及更加深入的分子機(jī)制來探討三種疾病致病機(jī)制的異同。