王昕　葸慧榮　楊芳芳　何蕾　馬慧萍

摘要：目的 優(yōu)選藏藥柳茶總?cè)频奶崛「患に嚥⒀芯科淇谷毖趸钚?。方?通過(guò)小鼠常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)篩選柳茶總?cè)频奶崛∪軇?；再以總?cè)坪?、提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)考察提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比，優(yōu)選柳茶總?cè)频奶崛」に嚕蝗缓罂疾齑罂孜綐?shù)脂類(lèi)型、上樣濃度、洗脫劑濃度、洗脫劑體積，優(yōu)選其富集工藝；最后通過(guò)小鼠常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)和急性減壓缺氧實(shí)驗(yàn)研究其抗缺氧活性。結(jié)果 優(yōu)選的提取工藝為：70%乙醇提取，料液比為1∶20，提取2次，每次1.5 h，平均總?cè)坪靠蛇_(dá)32.25%；優(yōu)選的富集工藝為：AB-8型大孔吸附樹(shù)脂，上樣濃度為2 mg/mL，80%乙醇5 BV洗脫，總?cè)坪靠蛇_(dá)61.09%；柳茶總?cè)瓶谷毖趸钚暂^強(qiáng)，且存在一定的劑量依賴(lài)性。結(jié)論 本研究?jī)?yōu)選的柳茶總?cè)铺崛「患に嚪€(wěn)定、重現(xiàn)性好，所得柳茶總?cè)凭哂酗@著的抗缺氧活性。

關(guān)鍵詞：柳茶；總?cè)?；提取工藝；富集工藝；抗缺?/p>

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.015

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2；R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）04-0071-06

Abstract： Objective To optimize the extraction and enrichment process of total triterpenes from Sibiraea Angustata； To study its anti-hypoxia activity. Methods The extraction solvent of total triterpenoids of Sibiraea Angustata was screened by atmospheric pressure anti-hypoxia test. The content of total triterpenes and extraction rate were set as evaluation indexes. The effects of extraction time， extraction times and ratio of material to liquid on extraction were investigated by orthogonal test. The extraction process was optimized. Resin type， concentration of sample， eluent concentration and eluent volume were investigated to optimize the enrichment process of total triterpenes of Sibiraea Angustata. Finally， the anti-hypoxia activity was studied by atmospheric pressure test and acute decompression test. Results The optimum extraction process was as follows： 70% ethanol extraction， the ratio of material to liquid was 1：20， extrat 2 times with 1.5 h for each time， and the content of total triterpenes was 32.25%. The optimum enrichment process was： AB-8-type macroporous adsorption resin， the loading concentration of 2 mg/mL， 80% ethanol 5 BV elution， and total triterpenes content was up to 61.09%； Sibiraea Angustata total triterpenes anti-hypoxia activity test was strong， and had a certain dose dependency. Conclusion The extraction and enrichment process of total triterpenes from Sibiraea Angustata is stable， reproducible and has significant anti-hypoxia activity.

Keywords： Sibiraea Angustata； total triterpenes； extraction process； enrichment process； anti-hypoxia

柳茶是薔薇科Rosaceae鮮卑花屬Sibiraea Maxim植物窄葉鮮卑花Sibiraea angustata（Rehd.）Hand-Mazz.的葉和嫩枝，是我國(guó)藏族民間傳統(tǒng)藥材，生長(zhǎng)在海拔3000～5000 m的高原地帶，分布在青海、西藏、云南及甘肅等地區(qū)，資源豐富。民間將窄葉鮮卑花作為茶飲，因其形狀似柳葉，故稱(chēng)“柳茶”。其功效為疏散風(fēng)熱，治療食積居多[1]。由于特殊的生長(zhǎng)環(huán)境，長(zhǎng)期地理氣候的劇變導(dǎo)致柳茶體內(nèi)的微量元素種類(lèi)和數(shù)量的分布也發(fā)生了一些新的變化[2]。柳茶中的化學(xué)成分以三萜類(lèi)為主[3]，主要包括熊果酸、齊墩果酸。此外，還含有部分單萜[4-8]、黃酮類(lèi)和揮發(fā)油等成分。有研究報(bào)道齊墩果酸和熊果酸均具有清除超氧陰離子、羥自由基和DPPH自由基的作用[9-10]，臨床主要用于消炎、保肝[11]、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂[12-13]、抗腫瘤[14]等，這些作用大多與其清除自由基與抗氧化活性相關(guān)。但是，關(guān)于柳茶三萜類(lèi)化合物的抗缺氧作用目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究首先通過(guò)常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)篩選柳茶總?cè)频奶崛∪軇?，采用正交試?yàn)優(yōu)選其提取工藝，然后采用大孔吸附樹(shù)脂優(yōu)選富集工藝，最后通過(guò)常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)和急性減壓缺氧實(shí)驗(yàn)研究其抗氧化活性，為藏藥柳茶的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

UV2800SPC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司），Spectramax i3多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司），AE240型萬(wàn)分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），SK3300L超聲清洗儀器（上海精密儀器儀表有限公司），RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），BHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司），HH-4電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司），AFX20501-P超純水機(jī)（重慶艾科浦外貿(mào)頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司），800型離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）。

柳茶藥材購(gòu)于甘肅省甘南藏族自治州合作市郊（海拔3200 m以上），經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)研究所楊永建教授鑒定其為薔薇科Rosaceae鮮卑花屬植物窄葉鮮卑花Sibiraea angustata（Rehd.）Hand-Mazz.的葉。乙酰唑胺原料藥（武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司，批號(hào)100114，純度≥98%），熊果酸對(duì)照品（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20161213，純度≥98%）；HPD500、AB-8、DA201、D101、LX-60大孔吸附樹(shù)脂（北京索萊寶科技有限公司）。乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

清潔級(jí)BABL/C雄性小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，5周齡，蘭州軍區(qū)陸軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科提供，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（軍）2014-0029。動(dòng)物自由攝食飲水。飼養(yǎng)室保持良好通風(fēng)，控制環(huán)境溫度24～26 ℃、相對(duì)濕度50%～60%，12 h循環(huán)光照。

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 方法與結(jié)果

2.1 柳茶總?cè)坪繙y(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品2.00 mg，用甲醇超聲溶于20 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL對(duì)照品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取0.1、0.2、0.3、0.6、0.8、1.0 mL對(duì)照品溶液，水浴揮干溶劑，依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，搖勻，加入高氯酸1.2 mL，60 ℃水浴15 min，取出，冷卻至室溫，加入5 mL冰乙酸，混勻后以顯色劑為空白于546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（顯色30 min內(nèi)測(cè)定）。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：Y=3.264 5X+0.043 7（r=0.999 2）。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取柳茶提取樣品4 mg于10 mL容量瓶中，甲醇超聲溶解。取0.5 mL各供試品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，于546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算總?cè)坪俊?/p>

2.2 吸水率考察

稱(chēng)取藥材5.0 g，分別稱(chēng)取3份，加25 mL水完全浸潤(rùn)，過(guò)濾，稱(chēng)重，計(jì)算吸水率。吸水率（%）=（藥材濕重-藥材干重）÷藥材干重×100%。結(jié)果見(jiàn)表1。吸水率為187.44%，因此初次加水需加2倍量的水。

2.3 小鼠常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)篩選提取溶劑

稱(chēng)取柳茶藥材25 g，分別加入水、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇提取，提取溫度為80 ℃，每次提取2 h，提取2次，合并提取液。減壓濃縮后揮發(fā)去溶劑，采用真空冷凍干燥制成細(xì)粉待用。將小鼠隨機(jī)分成缺氧模型組、水提取物組、70%乙醇提取物組、80%乙醇提取物組和95%乙醇提取物組，各給藥組灌胃劑量為500 mg/kg（藥液濃度10 mg/mL，灌胃體積1 mL），缺氧模型組給予等量生理鹽水，各組均灌胃5 d。最后一次給藥后60 min，將各組小鼠放入250 mL廣口瓶（瓶中事先放入5 g堿石灰，用于吸收二氧化碳與水分，并且在瓶底放入適量濾紙吸取尿液與糞便），在瓶口涂抹凡士林進(jìn)行密閉，隨后開(kāi)始計(jì)時(shí)，當(dāng)小鼠呼吸停止時(shí)結(jié)束計(jì)時(shí)，記錄小鼠在密閉實(shí)驗(yàn)瓶中的存活時(shí)間。延長(zhǎng)率（%）=（藥物組存活時(shí)間-模型組存活時(shí)間）÷模型組存活時(shí)間×100%，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，70%乙醇提取物抗缺氧活性最好，因此確定70%乙醇為提取溶劑。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

以總?cè)坪?、提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定的提取溫度為80 ℃，考察料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）3個(gè)因素對(duì)提取結(jié)果的影響。提取因素水平見(jiàn)表3。

2.4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

正交試驗(yàn)采用多指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)分采用加權(quán)法進(jìn)行處理。綜合評(píng)分=總?cè)坪俊?.5+提取率×0.5。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。各因素對(duì)提取結(jié)果的影響大小為B>A>C，其中B（提取溫度）對(duì)結(jié)果影響最大，因此，確定最佳工藝為A1B2C2，即提取溫度為80 ℃，加入20倍量70%乙醇，提取2次，每次1.5 h。

2.4.2 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

精確稱(chēng)取柳茶25 g，根據(jù)優(yōu)化的提取工藝進(jìn)行提取，重復(fù)工藝條件3次，計(jì)算總?cè)坪亢吞崛÷?，再將提取物?00 mg/kg予小鼠灌胃，通過(guò)常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗缺氧活性，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明正交試驗(yàn)所得的工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好，結(jié)果可靠。

2.5 大孔吸附樹(shù)脂優(yōu)化富集工藝

2.5.1 不同型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂篩選

將預(yù)處理過(guò)的5種大孔吸附樹(shù)脂（型號(hào)分別為D101、HPD200、HPD500、AB-8、LX-60）分別稱(chēng)取2.00 g，置于100 mL具塞三角瓶中，加入樣品溶液40 mL，以一定的速度振搖，每隔5 min搖30 s，持續(xù)振搖1 h，靜置8 h后進(jìn)行過(guò)濾。取濾液0.5 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算總?cè)频氖Ｓ嗔亢臀搅俊?/p>

將過(guò)濾后的樹(shù)脂置于125 mL容量瓶中，加入95%乙醇40 mL，于20 ℃以一定速度振搖，每隔5 min搖30 s，持續(xù)振搖1 h，靜置4 h充分解吸附，收集濾液，取濾液0.5 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算總?cè)频氖Ｓ嗔亢臀搅?，結(jié)果見(jiàn)表7。

結(jié)果表明，AB-8型和D101型樹(shù)脂的吸附率較高，而AB-8型樹(shù)脂的解析率較高，因此選用AB-8型樹(shù)脂進(jìn)行柳茶總?cè)频母患?/p>

2.5.2 上樣濃度對(duì)柳茶總?cè)莆降挠绊?/p>

將提取的柳茶粉末配成濃度分別為0.8、1、2、4、5 mg/mL的溶液，選用AB-8型樹(shù)脂，各濃度溶液上樣量200 mL，吸附2 h后，用95%乙醇同條件洗脫，收集洗脫液，測(cè)定總?cè)坪?。結(jié)果見(jiàn)圖1。可見(jiàn)，上樣濃度為2 mg/mL時(shí)，AB-8樹(shù)脂對(duì)藥材的吸附率最高，因此選用2 mg/mL為上樣濃度。

2.5.3 洗脫劑濃度對(duì)柳茶總?cè)平馕龅挠绊?/p>

取AB-8型樹(shù)脂，上樣量200 mL，濃度為2 mg/mL，吸附2 h后，以2 BV蒸餾水沖洗，再分別以2 BV的濃度分別為10%、30%、50%、80%、95%乙醇梯度洗脫，收集不同濃度的洗脫液，測(cè)定總?cè)坪?。結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，80%乙醇洗脫液中總?cè)频暮孔罡?，因此選擇80%乙醇進(jìn)行洗脫。

2.5.4 乙醇洗脫體積對(duì)柳茶總?cè)平馕龅挠绊?/p>

取等量的AB-8樹(shù)脂濕法上柱，上樣量為200 mL，上樣濃度為2 mg/mL，分別吸附2 h后，以2 BV蒸餾水洗脫，再用80%乙醇以1、2、3、4、5、6、7 BV體積洗脫，收集所有洗脫液，測(cè)定總?cè)坪浚Y(jié)果見(jiàn)圖3。可見(jiàn)，當(dāng)以5 BV體積洗脫樹(shù)脂時(shí)，總?cè)频南疵撀首畲?，而?dāng)再增加洗脫劑體積時(shí)，總?cè)频南疵撀驶緹o(wú)變化，因此選擇以5 BV體積的80%乙醇進(jìn)行洗脫。

2.6 抗缺氧活性驗(yàn)證

2.6.1 小鼠常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)

將小鼠，隨機(jī)分為缺氧模型組、陽(yáng)性藥組（乙酰唑胺，灌胃劑量為350 mg/kg）及柳茶總?cè)聘?、中、低劑量組（灌胃劑量分別為375、250、125 mg/kg），每組10只。各組均連續(xù)灌胃5 d。按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證柳茶總?cè)频目谷毖趸钚裕Y(jié)果見(jiàn)表8。與缺氧模型組比較，柳茶總?cè)聘?、中、低劑量組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），表明其抗缺氧活性較強(qiáng)。

2.6.2 小鼠急性減壓缺氧實(shí)驗(yàn)

小鼠分組方法與“2.6.1”項(xiàng)下相同，各組小鼠灌胃5 d，最后一次灌胃結(jié)束后50 min，將小鼠置于高原低壓低氧模擬氧艙中，將海拔升至10 000 m，停留1 h后，計(jì)算小鼠死亡率，結(jié)果見(jiàn)表9。可見(jiàn)，柳茶總?cè)聘患锞哂休^強(qiáng)的抗缺氧活性，并且其抗缺氧活性呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。

3 討論

傳統(tǒng)溶劑提取方法主要包括煎煮法、浸漬法、回流法和滲漉法[15]，選擇不同的提取方法需要從經(jīng)濟(jì)、提取效率、實(shí)驗(yàn)周期等多方面考慮。中藥提取時(shí)合理的提取工藝和指標(biāo)的選擇能夠有效地評(píng)價(jià)工藝的優(yōu)良[16]。本試驗(yàn)在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用回流法提取柳茶總?cè)?，選擇提取溫度為80 ℃，正交試驗(yàn)對(duì)料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)常見(jiàn)影響因素進(jìn)行考察。在這3種因素中，料液比的增加可以提高溶劑與藥材的接觸面積，加速有效成分的浸出，基于前期試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)從有效成分的浸出率以及經(jīng)濟(jì)方面考慮，選取料液比為1∶10、1∶15、1∶20進(jìn)行考察；提取時(shí)間可以改變藥物的有效成分從細(xì)胞壁中分離的時(shí)速，但是，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使藥物中有效成分的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而被破壞。一般藥材在提取2 h以上藥液中有效成分的濃度不會(huì)再顯著提高，因此，從保護(hù)有效成分的角度出發(fā)，選取提取時(shí)間為2、1.5、1 h進(jìn)行考察；提取次數(shù)增多可以提高有效成分在藥液中的濃度，根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果分析，藥材提取3次以上其藥液濃度變化不明顯，因此，從節(jié)約溶劑成本與提高藥液濃度出發(fā)，選取提取次數(shù)為1、2、3次進(jìn)行考察。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析及方差分析，3種因素對(duì)柳茶總?cè)铺崛〉挠绊懘笮∫来螢椋禾崛r(shí)間>料液比>提取次數(shù)，其中提取時(shí)間的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在3種因素中，提取時(shí)間的影響最大，筆者推測(cè)柳茶中三萜化合物的環(huán)狀結(jié)構(gòu)會(huì)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生重排，結(jié)構(gòu)改變會(huì)導(dǎo)致其有效成分被破壞。此外，料液比和提取次數(shù)為次要影響因素，這可能是在提取柳茶總?cè)茣r(shí)，溶劑和提取次數(shù)改變對(duì)結(jié)果的影響較小。最終確定的工藝為：提取溫度為80 ℃，加入20倍量70%乙醇，提取2次，每次1.5 h，柳茶總?cè)坪靠蛇_(dá)32.25%。

大孔吸附樹(shù)脂對(duì)天然藥物成分的吸附具有一定選擇性，最終可達(dá)到富集純化的目的。為了能夠制備符合要求的中藥有效部位原料藥，在確定提取工藝的基礎(chǔ)上以柳茶總?cè)坪繛樵u(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行富集工藝的優(yōu)化，最后確定的富集工藝為：AB-8型大孔吸附樹(shù)脂濕法上柱，上樣濃度為2 mg/mL，吸附2 h，以2 BV體積的蒸餾水沖洗，10%乙醇洗去雜質(zhì)，再以5 BV的80%乙醇以2 BV/h速度洗脫，總?cè)坪靠蛇_(dá)61.09%，將總?cè)坪枯^提取物提高了0.9倍，其抗缺氧活性也提高了1倍，表明AB-8型樹(shù)脂對(duì)柳茶總?cè)频母患Ч己谩?/p>

小鼠在缺氧條件下體內(nèi)的能量代謝出現(xiàn)障礙，生理功能紊亂，表現(xiàn)為一些蛋白質(zhì)如缺氧誘導(dǎo)因子-1α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、Nrf2等代謝出現(xiàn)異常，產(chǎn)生自由基的蓄積，氧化應(yīng)激系統(tǒng)障礙[17]，影響其各項(xiàng)生理活動(dòng)且體內(nèi)的自我調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂以致死亡。常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)以小鼠存活時(shí)間延長(zhǎng)率為指標(biāo)，判斷藥物抗缺氧活性的優(yōu)劣[18]。小鼠在常壓密閉條件下產(chǎn)生過(guò)氧化應(yīng)激，自由基大量堆積，使心肌受到嚴(yán)重?fù)p害[19]，最終導(dǎo)致小鼠死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柳茶總?cè)聘鲃┝拷M均能不同程度地延長(zhǎng)小鼠缺氧狀態(tài)下的存活時(shí)間，抗缺氧作用顯著，且柳茶總?cè)频目谷毖趸钚猿蕜┝恳蕾?lài)性。急性減壓缺氧實(shí)驗(yàn)?zāi)M高原低壓缺氧環(huán)境，根據(jù)小鼠的存活率判斷其抗急性缺氧能力的強(qiáng)弱，從而評(píng)定藥效優(yōu)劣。低壓氧艙模擬10 000 m缺氧環(huán)境造成的缺氧模型實(shí)驗(yàn)表明，3種劑量均能使缺氧狀態(tài)下小鼠的存活率提高，且柳茶總?cè)聘邉┝拷M存活率最高。常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)及急性減壓缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，柳茶總?cè)凭哂休^強(qiáng)的抗缺氧活性，其抗缺氧活性呈劑量依賴(lài)性。但是其抗缺氧作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)將評(píng)價(jià)藥材提取富集工藝的理化指標(biāo)（提取率、總?cè)坪浚┡c藥效學(xué)指標(biāo)（小鼠抗缺氧活性）綜合進(jìn)行評(píng)價(jià)，方法科學(xué)合理，重復(fù)性好，可以為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)藏藥柳茶提供依據(jù)。

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（收稿日期：2017-05-24）

（修回日期：2017-06-12；編輯：陳靜）