賈曉玉　張?zhí)m　羅藝　孔李婷　袁一平　郭兆娟　翟華強(qiáng)　楊翠翠

摘要：目的 觀察參芪醒腦方對(duì)氫溴酸東莨菪堿致癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）、乙酰膽堿酯酶（AChE）含量的影響，探討其防治老年癡呆的可能作用機(jī)制。方法 將ICR小鼠110只隨機(jī)分為對(duì)照組、對(duì)照+參芪醒腦方高劑量組、模型組、多奈哌齊組和參芪醒腦方低、中、高劑量組。對(duì)照組和模型組小鼠給予蒸餾水灌胃，其余各組小鼠給予相應(yīng)藥物灌胃，每日1次，連續(xù)14 d。第15日Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，行為學(xué)測(cè)試開始前20 min氫溴酸東莨菪堿腹腔注射誘發(fā)小鼠記憶障礙建立模型。Western blot檢測(cè)小鼠皮層及海馬組織ChAT、AChE蛋白表達(dá)。結(jié)果 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.01）；與模型組比較，參芪醒腦方中、高劑量組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05）。物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠對(duì)新事物探究能力明顯下降、分辨指數(shù)明顯降低（P<0.001）；與模型組比較，參芪醒腦方各劑量組小鼠分辨指數(shù)明顯升高（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦皮層及海馬組織AChE蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，參芪醒腦方低、中劑量組小鼠腦皮層AChE蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01），參芪醒腦方各劑量組小鼠腦海馬組織AChE蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.001），參芪醒腦方各劑量組小鼠腦皮層及海馬組織ChAT蛋白表達(dá)均未見明顯差異。結(jié)論 參芪醒腦方能明顯改善氫溴酸東莨菪堿致癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能與降低腦內(nèi)AChE蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：參芪醒腦方；阿爾茨海默?。粬|莨菪堿；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶；乙酰膽堿酯酶；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.012

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）04-0056-06

Abstract： Objective To observe the effects of Shenqi Xingnao Prescription on learning and memory ability， contents of choline acetyltransferase （ChAT） and acetylcholine esterase （AChE） in brain tissue in mice models with scopolamine-induced Alzheimer disease （AD）； To investigate its mechanism for prevention and treatment for AD. Methods Totally 110 ICR mice were randomly divided into control group， control+Shenqi Xingnao Prescription high-dose group， model group， donepezil group， model+Shenqi Xingnao Prescription high-， medium-， and low-dose groups. The control and model group were given distilled water for gavage， and the other groups were given the corresponding medicine for gavage， once a day， for 14 days. On the 15th day， Morris water maze test and object recognition test were used to evaluate the learning and memory ability of each group. The model mice of memory impairment induced by intraperitoneal injection of scopolamine was established 20 minutes before the behavioral test. The expressions of ChAT and AChE in cortex and hippocampus were detected by Western blot. Results The results of Morris water maze test showed that compared with the control group， the model group had significant longer escape latency （P<0.05）； Compared with the model group， Shenqi Xingnao Prescription medium- and high-dose groups could shorten the escape latency （P<0.05）. The results of the object recognition test showed that compared with the control group， the ability of the model group to explore new things decreased and the discrimination index （DI） decreased （P<0.001）； Compared with the model group， Shenqi Xingnao Prescription groups could increase the DI of model mice （P<0.05， P<0.01， P<0.001）. The results of Western blot showed that the expression of AChE protein in the cortex and hippocampus of the model group was significantly higher than the control group （P<0.01）； Compared with the model group， Shenqi Xingnao Prescription low- and medium-dose groups could decrease the expression of AChE in the cortex in different degrees （P<0.01）； Shenqi Xingnao Prescription groups could decreaed the expression of AChE in the hippocampus （P<0.001）； There was no significant statistical significance in the expression of ChAT in the cortex and hippocampus in each group. Conclusion Shenqi Xingnao Prescription can significantly improve the learning and memory ability of AD model mice induced by scopolamine， which may be related to the descent expression of AChE protein in the cortex and hippocampus of the model mice.

Keywords： Shenqi Xingnao Prescription； Alzheimer disease； scopolamine； choline acetyltransferase； acetylcholine esterase； mice

阿爾茨海默?。ˋlzheime disease，AD）是發(fā)生在老年期及老年前期的一種原發(fā)性退行性疾病，主要體現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙和行為損害，對(duì)患者的生活、社交等造成極大的影響。乙酰膽堿（Ach）是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，由膽堿能神經(jīng)元末梢釋放，參與神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)，與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)[1]。乙酰膽堿酯酶（AChE）能夠分解Ach，從而抑制信號(hào)的傳遞；而膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）可將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移到膽堿上，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)Ach的形成。當(dāng)老年癡呆發(fā)生時(shí)，腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元數(shù)量減少，導(dǎo)致Ach合成、貯存和釋放減少，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙[2]。研究表明，90%AD患者在神經(jīng)沖動(dòng)傳輸過程中缺乏膽堿[3-4]。因此，大腦內(nèi)Ach系統(tǒng)對(duì)于學(xué)習(xí)記憶功能的形成和維持發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)功能的膽堿酯酶抑制劑成為AD藥物研究的一個(gè)主要方向[5]。但目前臨床治療癡呆所選用的乙酰膽堿酯酶抑制劑，如他克林、多奈哌齊等，只能緩解癥狀，不能完全抑制或逆轉(zhuǎn)AD的神經(jīng)退行性病變發(fā)展進(jìn)程，治療效果并不理想，而且長(zhǎng)期服用不良反應(yīng)大。

AD屬中醫(yī)學(xué)“癡呆”“郁證”等范疇，王永炎院士認(rèn)為“氣虛-血瘀-痰瘀-釀毒-病絡(luò)”為老年性癡呆早期的核心病機(jī)，其中氣血虧虛是老年性癡呆早期發(fā)生的前提條件，痰濁瘀血是引起老年性癡呆的病理因素，毒損腦絡(luò)和病絡(luò)是早期癡呆發(fā)生的病機(jī)核心，使髓減腦消、神機(jī)失用，日久則發(fā)為呆病[6]。因此，針對(duì)以上病機(jī)，中醫(yī)臨床防治癡呆多以益氣健脾、活血化瘀治其本，化痰清濁、解毒通絡(luò)、醒腦開竅治其標(biāo)，以使氣血充足、腦髓充盈、神機(jī)復(fù)用。本實(shí)驗(yàn)所選用的參芪醒腦方由人參、黃芪、黃芩等組成，具有益氣健脾、活血化瘀、安神益智、解毒通絡(luò)之功效。臨床上以參芪醒腦方的顆粒劑型給藥治療24周后，參芪醒腦顆粒組對(duì)中醫(yī)證候評(píng)定分?jǐn)?shù)有改善作用，而且在簡(jiǎn)易精神狀態(tài)評(píng)價(jià)量表得分、老年癡呆量表-認(rèn)知評(píng)分上優(yōu)于多奈哌齊組[7]，但其作用機(jī)制并不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)以東莨菪堿致小鼠癡呆為模型，觀察參芪醒腦方對(duì)東莨菪堿致癡呆小鼠的行為學(xué)和腦組織ChAT、AchE蛋白表達(dá)的影響，探討參芪醒腦方改善東莨菪堿致癡呆小鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力的可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及飼料

ICR小鼠110只，SPF級(jí)，4～5周齡，體質(zhì)量（20±2）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于室溫（22±2）℃、相對(duì)濕度45%～60%環(huán)境，自由攝食飲水，分籠飼養(yǎng)。Co60滅菌飼料，北京科奧協(xié)力飼料有限公司。

1.2 藥物

參芪醒腦方（人參、黃芪、黃芩等），采用醇水雙提法提取，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供，藥物濃度為2.24 g原藥材/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。鹽酸多奈哌齊片，衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司，批號(hào)15020166。

1.3 主要試劑與儀器

氫溴酸東莨菪堿（Sigma公司）小鼠抗GAPDH一抗（北京中杉金橋），兔抗AChE一抗（Abcam， ab183591），兔抗ChAT一抗（Abcam， ab18736），山羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋），山羊抗兔二抗（北京中杉金橋）。自制物體識(shí)別設(shè)備（首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室），Multiskan Spectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo Fisher公司），低溫高速離心機(jī)（FRESCO 21，Sigma公司），純水儀（PACIFICⅡ，Thermo Fisher公司），微量移液器（Thermo Fisher公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與給藥

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組16只、對(duì)照+參芪醒腦方高劑量組15只、模型組17只、多奈哌齊組14只和參芪醒腦方低、中、高劑量組（1.25、2.5、5 g/kg）各16只。屏障環(huán)境適應(yīng)1周后開始給藥，對(duì)照組與模型組予蒸餾水灌胃，其余各組給予相應(yīng)藥物灌胃。參芪醒腦方、多奈哌齊（1 mg/kg）給藥相當(dāng)于60 kg成人體質(zhì)量10倍臨床用量。給藥體積為0.1 mL/10 g，每日1次，連續(xù)14 d。

2.2 造模

腹腔注射氫溴酸東莨菪堿1 mg/kg誘發(fā)小鼠記憶障礙建立模型，行為學(xué)開始前20 min注射造模。

2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)裝置為一個(gè)直徑80 cm，內(nèi)表面黑色的圓形水池。將水池隨機(jī)分為4個(gè)象限，逃逸平臺(tái)放置在第2象限中央，位于水面下1 cm，實(shí)驗(yàn)時(shí)平臺(tái)位置固定不變。實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)給藥，前2 d為訓(xùn)練階段，不給予氫溴酸東莨菪堿造模，觀察小鼠視覺及運(yùn)動(dòng)能力有無差別，對(duì)于有障礙的小鼠予以剔除。實(shí)驗(yàn)為期5 d，每日上、下午各進(jìn)行1次，上午從第1象限入水，下午從第4象限入水。實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行，第3日開始定位航行實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)開始前20 min小鼠腹腔注射東莨菪堿，每隔2 min注射1只，以保證小鼠在進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)時(shí)體內(nèi)血藥濃度保持一致。小鼠面朝壁從象限中間位置入水，記錄小鼠120 s內(nèi)找到平臺(tái)時(shí)間，記作逃避潛伏期。結(jié)束后，讓其在平臺(tái)上學(xué)習(xí)15 s。120 s未找到平臺(tái)的小鼠，逃避潛伏期記為120 s。

2.4 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

第1日，將小鼠放在475 mm×350 mm×200 mm的空盒子里自由探索5 min。第2日，在盒子里放置2個(gè)相同的物體，記錄小鼠5 min內(nèi)對(duì)2個(gè)物體的探索時(shí)間（視小鼠鼻子靠近物體1 cm內(nèi)為開始）。第3日，將其中1個(gè)物體換成新物體，記錄小鼠在5 min內(nèi)對(duì)新舊物體的探索時(shí)間。分辨指數(shù)=（新物體時(shí)間-舊物體時(shí)間）÷（新物體時(shí)間+舊物體時(shí)間）。

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

2.5.1 腦組織勻漿制備

行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，冰上取材，分離出皮層、海馬等組織。將動(dòng)物組織（皮層或者海馬）稱重后按1∶7加裂解液裂解，超聲勻漿21 s（7 s×3次），冰上裂解30 min，取出一部分裂解后的組織加5×上樣緩沖液（Loading buffer）混勻（其余組織-80 ℃凍存），95 ℃加熱5 min，12 000 r/min離心30 min，收取上清液，即得變性后蛋白樣品。

2.5.2 膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酰膽堿酯酶蛋白表達(dá)測(cè)定

將變性后的蛋白樣品，采用改良RC-DC法進(jìn)行蛋白定量。取30 μg蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜，封閉2 h后，加入一抗兔多克隆抗體孵育1.5 h，4 ℃過夜，TBST漂洗5 min×3次，加入山羊抗兔二抗孵育2 h，TBST漂洗5 min×3次，用化學(xué)發(fā)光液發(fā)光，以GAPDH作為內(nèi)參，以目標(biāo)蛋白/GAPDH為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 參芪醒腦方對(duì)東莨菪堿致癡呆小鼠模型逃避潛伏期的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，參芪醒腦方中、高劑量組小鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表1。

4.2 參芪醒腦方對(duì)模型小鼠分辨指數(shù)的影響

與對(duì)照組比較，模型組分辨指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；與模型組比較，參芪醒腦方各劑量組小鼠分辨指數(shù)顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01，P<0.001），并有劑量依賴性趨勢(shì)。結(jié)果見表2。

4.3 參芪醒腦方對(duì)模型小鼠腦皮層膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酰膽堿酯酶蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦皮層AChE蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，參芪醒腦方低、中劑量組小鼠腦皮層AChE蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05），參芪醒腦方高劑量組小鼠腦皮層AChE蛋白表達(dá)有降低趨勢(shì)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。各組間小鼠腦皮層ChAT蛋白表達(dá)均未見明顯差異，見圖2。

4.4 參芪醒腦方對(duì)模型小鼠腦海馬組織膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酰膽堿酯酶蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組AChE蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，參芪醒腦方各劑量組小鼠腦海馬組織AChE蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見圖3。各組間小鼠腦海馬組織ChAT蛋白表達(dá)均未見明顯差異，見圖4。

5 討論

Ach由膽堿、乙酰輔酶A在ChAT的催化下合成，存在于全身的神經(jīng)組織中，而腦中Ach介導(dǎo)大腦神經(jīng)元的傳導(dǎo)，是多重神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)和記憶過程的重要神經(jīng)遞質(zhì)。人體缺少Ach則會(huì)加速腦細(xì)胞的衰老，使記憶力顯著下降，甚至導(dǎo)致老年癡呆。

東莨菪堿是M受體阻斷劑，可以拮抗Ach與M受體的結(jié)合，阻斷大腦信息的傳遞，干擾短期記憶能力，從而引起記憶獲得障礙[8-9]。Jackson J J等[10]研究表明，東莨菪堿可引起大鼠腦皮質(zhì)AChE活性升高，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。另外，東莨菪堿制備癡呆模型具有簡(jiǎn)便易行、經(jīng)濟(jì)有效等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于初步篩選促智藥物和防治阿爾茨海默病的藥物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予1 mg/kg東莨菪堿可造成小鼠獲得性記憶障礙模型，與報(bào)道一致[11-12]。

參芪醒腦方是在總結(jié)王永炎教授長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上提煉的治療AD的經(jīng)驗(yàn)方，方中黃芪健脾益氣、升陽舉陷、托毒排膿，人參大補(bǔ)元?dú)?、安神益智、補(bǔ)脾益肺生津，黃芩清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血，全文共奏健脾益氣、安神益智、活血化瘀、解毒通絡(luò)之功效。其有效成分主要為人參皂苷、黃芪總苷、黃芩苷等?，F(xiàn)代藥理研究表明，人參皂苷 Rb1可促進(jìn)Ach的釋放，增加神經(jīng)末梢對(duì)其的攝取，發(fā)揮改善記憶的作用，并抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[13]；人參皂苷Rg1能夠減少Aβ1-42蛋白的表達(dá)和tau蛋白的磷酸化，并能上調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[14]。有研究者認(rèn)為，黃芪總苷是一種天然的過氧化物酶體增殖劑激活受體γ激動(dòng)劑，通過降低β-分泌酶的活性能最終下調(diào)Aβ的表達(dá)[15]。黃芩苷能夠上調(diào)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，從而提高機(jī)體的抗氧化能力[16]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)防性給藥14 d后，一次性腹腔注射東莨菪堿進(jìn)行造模，造成學(xué)習(xí)記憶功能受損。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，參芪醒腦方能夠改善模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。有研究表明Ach在學(xué)習(xí)和記憶過程中起著關(guān)鍵作用，對(duì)學(xué)習(xí)的速度甚至學(xué)習(xí)的質(zhì)量都有影響[17]。AChE則能夠快速水解Ach生成乙酸和相應(yīng)的膽堿，使其在膽堿能突觸處終止神經(jīng)傳輸。ChAT和AChE共同作用維持Ach含量的動(dòng)態(tài)平衡，二者的活性反映Ach在腦中的合成和代謝速率[18-19]。參芪醒腦方能夠降低腦組織內(nèi)AChE含量，但對(duì)ChAT表達(dá)無明顯影響，提示參芪醒腦方可能通過抑制AChE的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)Ach的代謝來改善學(xué)習(xí)記憶能力。此外，參芪醒腦方具有中藥復(fù)方多途徑、多靶點(diǎn)的特性。加之，有效成分含量高、體積小、不含浸出溶媒、可久貯等優(yōu)點(diǎn)，因此，其成藥性強(qiáng)，可成為有效治療AD的候選藥。

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（收稿日期：2017-08-02）

（修回日期：2017-09-23；編輯：華強(qiáng)）