聶　龍　周方正　童　琳　潘東風(fēng)　張東升　王小聰　謝　輝　郭思言

微小RNA(miRNA)是1種能夠參與蛋白的合成以及調(diào)控機(jī)體細(xì)胞活動(dòng)的小分子非編碼RNA，其長(zhǎng)度大約在21～25個(gè)核苷酸[1]。據(jù)研究報(bào)道，miR-155在肺癌[2]，乳腺癌[3]和胰腺癌[4]等多種腫瘤中均存在高表達(dá)。但是還未見(jiàn)miR-155在食管癌中表達(dá)的相關(guān)研究報(bào)道。因此本研究通過(guò)采用RT-PCR方法檢測(cè)miR-155在食管癌組織以及癌旁組織中的表達(dá)差異，并分析兩者的表達(dá)與食管癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，進(jìn)而探討其對(duì)食管癌發(fā)生，轉(zhuǎn)移的影響。

1　材料與方法

1.1　一般資料

選取2014年5月至2016年6月本院食管癌手術(shù)切除標(biāo)本及對(duì)應(yīng)的癌旁組織各80例，其中男性52例，女性28例，平均年齡42～76歲，所有患者術(shù)前均未接受化療，放療等其他療法，所有組織標(biāo)本分別于癌旁組織4 cm以?xún)?nèi)、無(wú)壞死癌灶及正常黏膜組織處取材。組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，包埋后連續(xù)切片，切片厚度控制在4 μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE)染色，經(jīng)專(zhuān)業(yè)病理科老師診斷確診為食管癌。按WHO分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)(1996)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)：高分化34例，中分化25例，低分化21例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例。標(biāo)本采集經(jīng)本院醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批和認(rèn)可。

1.2　方法

1.2.1主要試劑Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和cDNA擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)自MBI Fermentas公司。BioRAD-IQ5 qRT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)組織中miR-155的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用Trizol試劑一步法提取細(xì)胞中的RNA，將細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后擴(kuò)增成DNA(所有步驟嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)。miR-155引物序列：上游：5-CTGTATCAAAAGGCCAACTGAA-3，下游：5-GTGTCTATCCTTATGAATCGCCA-3；以GAPDH作為內(nèi)參，引物序列：上游：5-CATGGGGTGTGAACCATGAGA-3；下游：5-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3。所有引物序列均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。RT-PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃變形30 s，50 ℃退火30 s，70 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，最后70 ℃延伸10 min結(jié)束。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad,USA)測(cè)條帶灰度值。

1.2.3miR-155表達(dá)水平的計(jì)算方法以目的基因miR-155與內(nèi)參基因GAPDH灰度值的比值反映miR-155的相對(duì)表達(dá)量。至少選取3例數(shù)據(jù)求取平均值。取食管癌患者癌旁正常組織miR-155的表達(dá)水平為1，以此為對(duì)照，計(jì)算食管癌患者癌組織中miR-155的表達(dá)水平(以倍數(shù)表示)[5]。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。miR-155表達(dá)與食管癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間的比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　miR-155在食管癌組織與癌旁組織中的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，食管癌組織中miR-155的表達(dá)水平為0.437±0.091，與癌旁組織相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.184，P=0.007)，見(jiàn)圖1。

2.2　miR-155表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系

食管癌組織中miR-155表達(dá)與患者性別和年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)；與食管癌組織學(xué)分級(jí)，腫瘤浸潤(rùn)深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均有一定的關(guān)系(P<0.05),見(jiàn)表1。

1為食管癌組織；2為癌旁組織

表1　miR-155表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系

3　討論

Has-miR-155是非編碼基因BIC(B-cell integration cluster，BIC)轉(zhuǎn)錄所形成。近年的研究更多的聚焦于機(jī)體炎癥反應(yīng)調(diào)控以及血液性腫瘤的研究，但是關(guān)于miR-155與實(shí)體腫瘤的相關(guān)性研究少見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，食管癌患者組織中miR-155的表達(dá)水平顯著低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)對(duì)80例食管癌組織中miR-155的表達(dá)水平與患者臨床病理之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)食管癌組織中miR-155的表達(dá)與患者的性別和年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)；與患者食管癌的組織學(xué)分級(jí)，腫瘤的浸潤(rùn)深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均有一定的關(guān)系(P<0.05)。

有研究發(fā)現(xiàn)miR-155在肺癌[6]，胃癌[7]和乳腺癌[8]等實(shí)體腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)報(bào)道m(xù)iR-155的高表達(dá)與其抑癌作用存在一定的關(guān)系。Dorsett等[9]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的miR-155通過(guò)抑制AID(activation-induced cytidine deaminase)產(chǎn)生的潛在癌基因轉(zhuǎn)位來(lái)發(fā)揮抗癌的作用。同期研究中也有報(bào)道m(xù)iR-155高表達(dá)與促癌作用存在一定的聯(lián)系。Ovcharenko等[10]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的miR-155可以通過(guò)抑制凋亡基因caspase-3的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤的凋亡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。Valeri等[11]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌患者組織中miR-155的表達(dá)水平與錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1或MSH2表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，結(jié)果提示miR-155可以通過(guò)調(diào)控錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1或MSH2表達(dá)來(lái)促進(jìn)結(jié)腸癌腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。Pedersen等[12]在造血細(xì)胞增殖機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，SHIP1是調(diào)節(jié)造血細(xì)胞增殖與分化的因子，而miR-155可以作用了靶基因SHIP1進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。Jiang等[13]在乳腺癌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)miR-155可以通過(guò)抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白1來(lái)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)。

近年的研究也證實(shí)，miR-155在炎癥反應(yīng)和免疫中發(fā)揮中重要的作用。miR-155可以通過(guò)上調(diào)炎性T細(xì)胞的活性來(lái)促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[14]。Vigorito等[15]研究也發(fā)現(xiàn)miR-155在淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。另外，miR-155基因敲除的老鼠細(xì)胞因子的分泌降低并且T細(xì)胞依賴(lài)的抗體反應(yīng)減弱[16]。而炎癥細(xì)胞和炎癥反應(yīng)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。因此我們推測(cè)食管癌患者組織中miR-155表達(dá)的降低可能是導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)以及抗癌機(jī)制的失衡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

綜上，食管癌患者組織中miR-155的相對(duì)表達(dá)降低，可能抑制了機(jī)體抗癌作用，從而促進(jìn)食管癌的發(fā)生與發(fā)展，但是具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。