孫楊安　楊小文　付紅萍　周巧玲　陳志軍　王忠軍　吳　昆　陳文學　傅愛榮

腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移都是由多種基因、多個蛋白信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控及多步驟協(xié)同發(fā)生的生物學過程，近年來消化道惡性腫瘤發(fā)病率有逐漸上升趨勢，且死亡人數(shù)增加，因此，尋找新的消化系統(tǒng)腫瘤標志物以及控制惡性腫瘤的惡化及轉(zhuǎn)移，對其早期發(fā)現(xiàn)、診斷、治療及預后判斷有重要意義。近幾年的研究表明細胞型朊蛋白對癌癥細胞的生長、爬行和抗藥性都有作用，提示細胞型朊蛋白可能與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲以及轉(zhuǎn)移等有著密切的關系[1-2]。本研究對細胞型朊蛋白在胰腺癌、胃腺癌及結(jié)直腸腺癌中的表達使用免疫組織化(ELISA)檢測，初步探討其在胰腺癌、胃腺癌及結(jié)直腸腺癌中發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移中的作用。

1　材料與方法

1.1　一般資料

隨機挑選江西省腫瘤醫(yī)院腹部外科2013年12月至2016年6月手術(shù)切除的胰腺癌標本30例：男性16例，女性14例；年齡(61.5±8.5)歲，其中年齡≥60歲14例，年齡<60歲16例；高/中分化腺癌患者17例、低分化腺癌患者13例；根據(jù)中國臨床腫瘤學會(CSCO)胰腺癌TNM分期，Ⅰ～Ⅱ患者15例、Ⅲ～Ⅳ期患15例；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者14例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者16例。同一時期收集腫瘤切緣未受癌浸潤的胰腺組織(距癌腫2 cm之外，經(jīng)HE染色證實為無癌組織)標本15例作為對照。

隨機挑選江西省腫瘤醫(yī)院腹部外科2013年12月至2016年6月手術(shù)切除的胃腺癌標本70例：男性36例、女性34例，年齡(62.5±8.5)歲(年齡≥60歲37例，年齡<60歲33例)，高/中分化患者 31例、低分化腺癌患者39例，根據(jù)中國臨床腫瘤學會(CSCO)胃癌TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期患者36例、Ⅲ～Ⅳ期患者34例，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者45例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者25例。同一時期收集腫瘤切緣未受癌浸潤正常胃組織(距癌腫2 cm之外，經(jīng)HE染色證實為無癌組織)標本30例作為對照。

隨機挑選江西省腫瘤醫(yī)院腹部外科2013年12月至2016年6月手術(shù)切除的結(jié)直腸腺癌標本70例：男性32例、女性38例，年齡(60.5±9.5)歲(年齡≥60歲36例，年齡<60歲34例)，高/中分化腺癌患者 32例、低分化腺癌患者38例，根據(jù)中國臨床腫瘤學會(CSCO)結(jié)直腸癌TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期患者32例、Ⅲ～Ⅳ期患者38例，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者46例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者24例。同一時期收集腫瘤切緣未受癌浸潤結(jié)直腸組織(距癌腫2 cm之外，經(jīng)HE染色證實為無癌組織)標本30例作為對照。

標本通過福爾馬林浸泡常規(guī)固定后石蠟包埋備用。所有入選患者術(shù)前均無放療及化療史，術(shù)后經(jīng)病理明確診斷。

1.2　主要試劑與儀器

小鼠抗人PrPC單克隆抗體購于美國Abcam公司，生物素化的山羊抗小鼠 HRP-con-jugated IgG 二抗、DAB 顯色試劑盒及正常山羊血清均購于北京中杉金橋公司。其余試劑與儀器由我院病理科及腫瘤研究室提供使用。

1.3　實驗方法

腫瘤標本石蠟常規(guī)包埋，按標準經(jīng)4 μm連續(xù)切片，60 ℃烘烤切片24 h后保存。切片按流程通過脫蠟、水化及抗原修復等，PBS沖洗，過氧化氫酶阻斷液(3%H2O2)將裝有切片的切片架浸泡10 min，從而滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。再將切片浸入枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)高壓鍋中緩慢加熱至沸騰(注意：整張切片需被緩沖液浸沒)，持續(xù)加熱10 min，取出切片，待其自然冷卻，蒸餾水沖洗3次后，PBS緩沖液浸泡切片5 min。正常山羊血清放置于室溫孵育10 min，不做沖洗。滴加兔抗人PrPC單克隆抗體 (以1∶200稀釋)，濕盒內(nèi)4 ℃12 h后PBS沖洗3次。滴加山羊抗小鼠HRP-conjugated IgG二抗，室溫孵育1 h后再次PBS清洗3次。滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，使用DAB顯色試劑盒，每張切片滴加新鮮配制的DAB溶液50～100 μl，室溫自然顯色，顯色時間控制在約5 min。顯微鏡下觀察染色直到出現(xiàn)陽性顯色(棕黃色或棕褐色)，蒸餾水洗滌切片。蘇木精復染、脫水、二甲苯透明及中性樹膠封片，室溫下自然干燥后鏡檢。實驗中陰性對照(用PBS代替一抗)，其余步驟同上。

1.4　結(jié)果判定

顯微鏡下細胞質(zhì)和(或)細胞核呈棕色或黃色染色則視為陽性染色，200倍鏡下隨機選取10個視野，計數(shù)1000細胞單位，通過每個視野中細胞染色深淺和陽性細胞數(shù)所占比率給組織染色評分，陽性細胞數(shù)比率>75%記4分、50%～75%記3分、25%～50%記2分、10%～25%記1分。與此同時，陰性對照比較著色強度分為4個等級評分：0、1、2、3分，細胞無染色為陰性評分0分，細胞質(zhì)和(或)細胞核呈淡棕色則為弱陽性評分1分，細胞質(zhì)和(或)細胞核呈棕色者為陽性評分2分，細胞質(zhì)和(或)細胞核深棕色為強陽性 評分3分。最后根據(jù)陽性細胞數(shù)比率與染色強度得分的乘積將組織染色結(jié)果進行評分分級：0～1為陰性(-)，2～4為弱陽性(+)，5～8為陽性(++)，9～12則為強陽性(+++)，陽性率=(陽性組總數(shù)+強陽性組總數(shù))/標本總例數(shù)。免疫組化的結(jié)果由2位病理醫(yī)師在不知曉臨床資料和病理資料的情況下，按照以上標準對免疫組化結(jié)果進行評估和統(tǒng)計。

1.5　統(tǒng)計學方法

選擇使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。胰腺癌、胃腺癌、結(jié)直腸癌的癌組織及正常組織中PrPC表達率差異的比較采用χ2檢驗，胰腺癌、胃腺癌、結(jié)直腸癌的癌組織中PrPC表達的強弱與臨床參數(shù)相關性及特異性的分析采用Spearman檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1　PrPC 在正常組織及癌組織中表達

PrPC在正常組織中的表達主要分布于上皮細胞的細胞間質(zhì)中，染色相對較淺，表達為陰性；而PrPC在癌組織中主要分布位于細胞核和細胞質(zhì)中，染色相對較深，呈棕色，表達為陽性。

2.2　PrPC在正常組織及癌組織中的陽性表達

在胰腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌的癌組織中表達率分別為73.3%(20/30)、65.7%(46/70)、68.5%(48/70)，癌周正常組織的 PrPC陽性表達率26.7%(8/30)、25.7%(18/70)、21.4%(15/70)。胰腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌與正常組織 PrPC陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　PrPC在正常組織及癌組織中的陽性表達(例，%)

2.3　PrPC在癌組織中表達與臨床參數(shù)的關系

PrPC在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織的表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織(P<0.05)，且 PrPC在高中分化腺癌中的表達率低于低分化腺癌，PrPC的表達和患者的性別無關(P>0.05)，癌組織中PrPC陽性表達率隨患者的臨床分期增高而增高，但差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

表2　PrPC 在消化道惡性腫瘤中的陽性表達與臨床病理特征的關系

3　討論

胰腺癌、胃癌及結(jié)直腸癌等消化道惡性腫瘤近年來發(fā)病率逐漸升高，消化道惡性腫瘤具有低生存率、易發(fā)生淋巴及血液轉(zhuǎn)移等特點，因此對消化道惡性腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷，對腫瘤的治療及預后的判斷并選擇相應的治療方案尤為重要。

1982年美國科學家 Prusiner首先發(fā)現(xiàn)朊蛋白在神經(jīng)生物學功能中發(fā)揮著重要作用。 人類朊蛋白基因定位于20號染色體短臂上，編碼氨基酸共有253個，編碼定位于細胞膜外表面，大量細胞膜表面受體和信號傳遞子在這一特殊的細胞膜結(jié)構(gòu)區(qū)域中表達[3-4]。正常細胞型PrPC本身并沒有致病性，但是在一定的條件下突變后可能轉(zhuǎn)化成致病型PrPsC構(gòu)象，缺乏內(nèi)源性PrPC會使PrPC介導的感染性及神經(jīng)毒性無處施展，PrPC還會自發(fā)地使阮蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒缘娜畹鞍?，從而導致朊病毒相關疾病的發(fā)生。PrPsC與PrPC通過多種細胞內(nèi)及細胞外的分子相互作用，朊蛋白的表達與功能的表現(xiàn)和這些分子相互作用有著密切的關系。有研究報道顯示細胞膜脂筏上的 PrPC能與包括FLNa在內(nèi)的一些細胞外基質(zhì)和黏附分子相互發(fā)揮作用，在細胞的增殖、粘附、遷徙等多種行為中，發(fā)現(xiàn)FLNa 分子可作為重要的信號轉(zhuǎn)導支架蛋白參與其中，介導細胞的增殖、分化和惡性變，干預多條與腫瘤形成相關的信號轉(zhuǎn)導通路，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[5-7]。此外，PrPC位于細胞表面的脂筏或細胞質(zhì)膜的微小細胞囊，可與細胞質(zhì)膜微囊的主要成分Caveolin 1相互作用，而Caveolin 1可正負調(diào)節(jié)多種腫瘤信號轉(zhuǎn)導機制，例如G蛋白偶聯(lián)性受體、MAPK/ERK、PKC，提示PrPC表達可能與許多人類腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系，近年來成為各國學者的關注熱點[8-10]。

細胞型朊蛋白在胰腺癌、胃癌及結(jié)直腸癌組織中的表達明顯高于良性組織，表明朊蛋白在這些惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中起著重要作用，但是其具體作用和表達方式仍未被證實?，F(xiàn)在已經(jīng)知道朊蛋白是一種膜糖蛋白，在核糖體合成后轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)進行加工折疊，然后運輸?shù)礁郀柣w，經(jīng)過糖基化修飾后再次轉(zhuǎn)運到細胞膜，最后定位于細胞膜的穴樣內(nèi)陷類結(jié)構(gòu)域(CLDs)。CLDs是朊蛋白的主要成分之一，新近的研究表明構(gòu)成CLDs的某些成分可在腫瘤細胞中高表達，并與腫瘤的惡性行為有一定相關，CLDs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡性轉(zhuǎn)化中起著重要的作用[11-12]，因此我們推測朊蛋白也參與了其中，在其中起著關鍵的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌、胃癌及結(jié)直腸癌的癌組織中PrPC陽性表達與癌組織分級有顯著關系，PrPC表達表現(xiàn)了癌細胞的一種增殖狀態(tài)，從而間接表現(xiàn)了癌細胞的惡性程度及侵襲性。 因此，PrPC有望成為胰腺癌、胃癌及結(jié)直腸癌等消化道惡性腫瘤的早期診斷、生物靶向治療的關鍵腫瘤標志性分子。 但 PrPC促進消化道惡性腫瘤進展的具體機制仍不清楚，確定PrPC在腫瘤細胞中的定位、掌握其在細胞凋亡過程中所起到的作用，從中發(fā)現(xiàn)其表達對腫瘤細胞的影響，尋找到朊蛋白是如何在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，是我們接下來的研究重點和方向。