胡　威　李浩勇　梁培育　程　帆　張孝斌

腎細(xì)胞癌是成人腎臟最常見的腫瘤。透明細(xì)胞腎癌(ccRCC)是腎癌最常見的病理類型，占75%，其次是非透明型，包括乳頭狀瘤(10%)、嫌色細(xì)胞瘤(5%)和其他罕見類型等[1]。腎細(xì)胞癌具有很高的死亡率和發(fā)病率，泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中穩(wěn)步上升，全球每年新發(fā)病例約為20萬例，超過10萬例患者死亡[2]。腎部分切除術(shù)或者根治性腎切除是該疾病的1種有效治療手段，但晚期腎細(xì)胞癌仍然是非常致命的，5年生存率約為53%[3]。ccRCC的發(fā)病機(jī)制一直是腎腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，深入探索ccRCC的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及找到相關(guān)的治療靶點(diǎn)是近年來該研究領(lǐng)域的前沿。

IGFBP-6是1個(gè)相對較新的IGFBP家族成員，已有研究表明其在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[4-8]，但在腎細(xì)胞癌中的作用尚未見報(bào)道。本研究旨在探討IGFBP-6的表達(dá)在人類ccRCC組織中的區(qū)域特征和空間分布，這將有助于我們了解IGFBP-6在人類CCRCC中的潛在作用。

1　材料與方法

1.1　標(biāo)本采集

所有34例患者均在武漢大學(xué)人民醫(yī)院行原發(fā)腎腫瘤切除術(shù)，均為單側(cè)根治性腎切除，并被我院病理科明確認(rèn)定為腎透明細(xì)胞癌，根據(jù)臨床及病理表現(xiàn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者有腰痛、血尿等癥狀，或在常規(guī)身體檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)并診斷為腎腫瘤，通過全腹部CT定性為腎原發(fā)腫瘤，并排除繼發(fā)于其他器官的腫瘤。

組織病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)：ccRCC標(biāo)本切片進(jìn)行HE染色，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞胞質(zhì)透明或?yàn)槭人嵝粤＜?xì)胞；組織間可見小的薄壁血管組成的網(wǎng)狀間隔；一些腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)為巢和腺泡結(jié)構(gòu)；少數(shù)腫瘤成分肉瘤樣結(jié)構(gòu)，巨細(xì)胞偶爾可見，提示預(yù)后差；少數(shù)腫瘤可見壞死、纖維粘液化、鈣化、骨化。標(biāo)本收集等過程經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書?；颊叩哪[瘤組織及配對癌旁組織取至同一手術(shù)標(biāo)本，及時(shí)收集儲存并用液態(tài)氮冷凍。

1.2　免疫組化檢測

組織經(jīng)石蠟包埋切片成5 μm厚的切片，免疫組織化學(xué)(IHC)根據(jù)Liang等[9]公布的方法分析。組織切片，經(jīng)3%過氧化氫孵育10 min，在黑暗中，在室溫下，以淬滅內(nèi)源過氧化物酶活性。然后進(jìn)行抗原檢測。隨后，在37°C下與正常的血清，切片，然后用一抗孵育(1∶200，IGFBP-6抗體，美國Santa Cruz公司)原抗(1∶50，美國Santa Cruz公司)在4 ℃過夜。在室溫下反應(yīng)15 min，PBS洗滌后，切片，以過氧化物酶標(biāo)記抗體在37 ℃ 40 min后，接著用一個(gè)3′-二氨基聯(lián)苯胺底物溶液反應(yīng)和Mayer蘇木精復(fù)染。IGFBP-6染色的組織陽性細(xì)胞百分率被定義如下：0分為無染色(-)；1～3分為弱陽性(+)，4～6分為中度陽性(++)，而≥7分代表強(qiáng)陽性(+++)。

1.3　實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測

IGFBP-6在ccRCC及其ANCT組織中mRNA的表達(dá)是由ABI 7300 RT-PCR分析系統(tǒng)完成。引物，CypD ：5′-gaggggctcaaacactctacg-3′(上游)和5′-ccatccgatccacacacca- 3′(下游)；β-actin：5′-gtggacatccgcaaagac-3′(上游)和5′- aaagggtgtaacgcaacta-3′(下游)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為1 μg，總RNA從每個(gè)組的細(xì)胞中分離。采用SYBR綠色熒光RT-PCR Master Mix擴(kuò)增cDNA(Takara)和引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。從94 s開始，在30°C下進(jìn)行擴(kuò)增，再反應(yīng)40個(gè)周期(94 ℃ 下 30 s,60 ℃下 60 s, 72 ℃下60 s)。所有的反應(yīng)進(jìn)行3次，并應(yīng)用ABI 7300系統(tǒng)SDS軟件分析mRNA的比值。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　IGFBP-6 在ccRCC組織及其配對的ANCT組織中的表達(dá)

在ccRCC組織及其配對的ANCT組織中IGFBP-6的mRNA及蛋白表達(dá)水平有顯著差異。在ANCT組織中，mRNA表達(dá)水平為(1±0.2)，明顯低于ccRCC標(biāo)本的(3.6±0.6)(P<0.01)(圖1)，根據(jù)相應(yīng)的免疫反應(yīng)強(qiáng)度，在ANCT組織中，IGFBP-6免疫反應(yīng)平均得分為(0.4±0.2)，具體得分10例為+，1例為+++，這明顯低于ccRCC組織的平均得分(2.8±0.4)(P<0.001)(具體得分8例為++，26列為+++)。IGFBP-6陽性表達(dá)顯著增強(qiáng)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖1　ANCT組織和ccRCC標(biāo)本中IGFBP-6 mRNA的表達(dá)

2.2　IGFBP-6表達(dá)與ccRCC臨床病理特征的關(guān)系

IGFBP-6表達(dá)與患者年齡、性別無顯著相關(guān)性，同時(shí)IGFBP-6表達(dá)與腫瘤TNM分期，腫瘤體積大小及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性，見表1。

表1　IGFBP-6表達(dá)與ccRCC臨床及病理特征相關(guān)性/例

3　討論

IGFBP-6是1個(gè)相對較新的IGFBP家族成員，其主要介導(dǎo)細(xì)胞的壞死，其與IGF-Ⅱ(胰島素樣生長因子-Ⅱ)的親和力IGF-Ⅰ (胰島素樣生長因子-Ⅰ )強(qiáng)大約50倍[10]。其這1特點(diǎn)使它成為1個(gè)非常有力的IGF-Ⅱ活性抑制劑，其對IGF-Ⅱ依賴性的腫瘤生長產(chǎn)生抑制作用[4-5]，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤，橫紋肌肉瘤和結(jié)腸癌[6-8]等已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。但在腎細(xì)胞癌中的作用尚未見報(bào)道。IGFBP-6除了可作為選擇性的抗癌治療靶點(diǎn)。同時(shí)，IGFBP-6可以調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和延緩細(xì)胞衰老[8,11]。先前的一些研究表明IGFBP-6是通過結(jié)合IGF-Ⅱ蛋白和阻斷IGF/insulin(胰島素/胰島素樣生長因子 )信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)來發(fā)揮作用。這其中也包含了IGF家族的獨(dú)立功能[9,12]。同時(shí)IGFBP-6是1個(gè)選擇性的抗癌治療靶點(diǎn)，也可以調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和延緩細(xì)胞衰老?；诒疚闹形覀冎饕膶?shí)驗(yàn)結(jié)果，免疫組化及RT-PCR，IGFBP-6 mRNA及蛋白在ccRCC組織中的表達(dá)均遠(yuǎn)高于其對照的癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP-6 在肝細(xì)胞癌組織水平中表達(dá)均高于癌旁組織，并提出該蛋白可能是肝癌的1種新的腫瘤標(biāo)志物[13]。IGFBP-6已經(jīng)證實(shí)對許多腫瘤細(xì)胞系中胰島素樣生長因子功能有抑制作用。IGFBP-6在乳腺癌中的表達(dá)，可通過不同的方式來調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞生長，如增加IGF的生物有效性或降低IGF抑制劑作用等[14]。 但是到目前為止，IGFBP-6 在ccRCC中的作用及其與ccRCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系并無報(bào)導(dǎo)。

本研究首次報(bào)告了IGFBP-6 在ccRCC組織及其癌旁組織中的表達(dá)存在差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 由此推測，IGFBP-6可能與ccRCC的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)IGFBP-6的表達(dá)與患者性別、年齡以及腫瘤的TNM分期，腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素?zé)o相關(guān)性。這些結(jié)果表明IGFBP-6的表達(dá)與ccRCC的發(fā)生呈正相關(guān)性。但是由于我們的臨床樣本量有限，其所涉及的具體機(jī)制等，例如細(xì)胞死亡途徑或其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等將在后續(xù)研究。