于文玫

(山東省莒縣中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，山東 莒縣　276599)

青娥丸收載于《中華人民共和國藥典：一部》(2015年版)[1]，由鹽杜仲、鹽補(bǔ)骨脂、大蒜(蒸熟粉碎成細(xì)粉)及核桃仁(炒后搗爛)4 味中藥組成，具有補(bǔ)腎強(qiáng)腰的作用，主要用于治療腎虛腰痛、起坐不利及膝軟乏力[1-3]。鹽杜仲作為君藥，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的作用[4-5]。杜仲含有多種黃酮類成分，在抗氧化、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、預(yù)防心血管疾病、防癌及抗癌方面具有明顯的效果[6-10]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)杜仲及鹽杜仲含量測(cè)定的報(bào)道較多[11-13]，但是尚未有青娥丸中杜仲的黃酮類成分含量測(cè)定的報(bào)道。本研究以青娥丸中君藥杜仲為研究對(duì)象，建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定5種黃酮類成分的含量，為完善青娥丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1　材料

1.1　儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(配有自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器及1260化學(xué)工作站)(美國Agilent公司)；Mettler XP 205型電子分析天平(瑞士Metter-Toledo公司)，Milli-Q型純化水儀(Millipore，Bedford公司)。

1.2　藥品與試劑

槲皮素對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100081—201610，含量99.1%)，山奈酚對(duì)照品(德思特生物技術(shù)公司，批號(hào)：DZ0031，含量98%)，紫云英苷對(duì)照品(德思特生物技術(shù)公司，批號(hào)：DZ0001，含量98%)，異鼠李素對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110860—201611，含量99.8%)，陸地錦苷對(duì)照品(德思特生物技術(shù)公司，批號(hào)：DZ10021，含量98%)；青娥丸(水蜜丸，南京同仁堂藥業(yè)有限責(zé)任公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z32020099，批號(hào)：170301、170302和170303)；甲醇為色譜純(德國Merck公司)；磷酸為優(yōu)級(jí)純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水(自制)；其他試劑為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2　方法與結(jié)果

2.1　色譜條件

色譜柱為Kinetex-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇(A)-1%磷酸溶液(B)，線性梯度洗脫，見表1；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長360 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl，高效液相色譜圖見圖1。

表1　線性梯度洗脫程序Tab 1　Gradient elution program

2.2　溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液：精密稱取陸地錦苷、紫云英苷、異鼠李素、山奈酚和槲皮素對(duì)照品適量，用甲醇溶解并定容，搖勻，配制成每1 ml含陸地錦苷1.312 mg、紫去英苷1.566 mg、異鼠李素1.097 mg、山奈酚0.607 mg和槲皮素0.763 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液：取本品，研碎，取約2.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱質(zhì)量，超聲(頻率100 kHz，功率100 W)處理30 min，補(bǔ)足質(zhì)量，過濾，放冷過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液：按照處方的比例配制缺少鹽杜仲的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照溶液。

A.空白溶劑；B.混合對(duì)照品溶液；C.陰性對(duì)照溶液；D.供試品溶液1.陸地錦苷；2.紫云英苷；3.異鼠李素；4.山奈酚；5.槲皮素A.blank solution; B.mixed control solution; C.negative control solution; D.test solution 1.glucosidonin; 2.astragalin; 3.isorhamnetin; 4.kaempferol; 5.quercetin圖1　高效液相色譜圖Fig 1　HPLC chromatogram

2.3　線性關(guān)系試驗(yàn)及檢測(cè)限(LOD)、定量限(LOQ)測(cè)定

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5及10 ml，分別置于100 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列濃度混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)(r)見表2。取最低濃度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋，以儀器的信噪比S/N=3時(shí)測(cè)定LOD，信噪比S/N=10時(shí)測(cè)定LOQ，見表2。

2.4　精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色

表2　線性關(guān)系考察及LOD、LOQ結(jié)果Tab 2　Results of linearity, LOD and LOQ

譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示， 陸地錦苷、紫云英苷、異鼠李素、山奈酚和槲皮素峰面積的RSD(n=6)分別為0.84%、0.22%、0.76%、0.68%和0.59%，表明儀器的精密度良好。

2.5　重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品(批號(hào)：170301)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算平均含量。結(jié)果顯示，陸地錦苷、紫云英苷、異鼠李素、山奈酚和槲皮素含量的RSD(n=6)分別為1.45%、1.26%、1.72%、1.38%和1.05%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.6　穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液(批號(hào)：170301)，分別于室溫(25 ℃)下放置0、2、4、8、12和24 h后進(jìn)樣測(cè)定，記錄各組分色譜峰面積。結(jié)果顯示，陸地錦苷、紫云英苷、異鼠李素、山奈酚和槲皮素峰面積的RSD分別為0.67%、0.93%、0.76%、0.61%和0.85%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7　加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批(批號(hào)：170301)己知含量的樣品約1.0 g，共6份，置于具塞錐形瓶中，精密加入混合對(duì)照品溶液500 μl，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算陸地錦苷、紫云英苷、異鼠李素、山奈酚和槲皮素的回收率，結(jié)果見表3。

表3　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 3　Results of recovery test (n=6)

2.8　光譜學(xué)純度考察

采用高效液相色譜儀自帶的DAD檢測(cè)器光譜學(xué)純度檢測(cè)功能，分別對(duì)5種成分色譜峰的光譜學(xué)純度進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，5種成分的光譜學(xué)純度值均在儀器給出的閾值范圍內(nèi)。表明陸地錦苷、紫云英苷、異鼠李素、山奈酚和槲皮素色譜峰均為單一的色譜峰，沒有色譜峰重疊干擾。

2.9　樣品含量測(cè)定

取3批青娥丸，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算陸地錦苷、紫云英苷、異鼠李素、山奈酚和槲皮素5種黃酮類成分的含量，結(jié)果見表4。

表4　含量測(cè)定結(jié)果(mg/g，n=2)Tab 4　Results of content determination (mg/g, n=2)

3　討論

本研究提取方法考察了超聲提取法、加熱回流提取法與索氏提取法，三種提取方法的提取效率均良好。超聲提取法可在室溫下進(jìn)行，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便。因此,最終選擇超聲提取法。

本研究考察了甲醇-水、甲醇-1%乙酸水溶液及甲醇-1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，結(jié)果顯示，甲醇-1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相、進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，5種成分能達(dá)到較好的分離，并且峰形正態(tài)，無托尾現(xiàn)象。本研究采用DAD檢測(cè)器光譜學(xué)純度考察方法對(duì)色譜圖中各成分色譜峰進(jìn)行純度考察。結(jié)果顯示，5種成分的光譜學(xué)純度值均在儀器給出的閾值范圍內(nèi)。表明5種檢測(cè)成分色譜峰均為單一的色譜峰，沒有色譜峰重疊干擾。此外，5種成分在360 nm波長處均具有較強(qiáng)的紫外吸收，因此，選擇360 nm作為檢測(cè)波長。

本研究對(duì)青娥丸中君藥杜仲的5種黃酮類特征性成分進(jìn)行提取富集及含量測(cè)定。通過對(duì)3批次青娥丸中5種黃酮類成分含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)所測(cè)5種成分的含量差異較小，說明青娥丸的質(zhì)量穩(wěn)定。本研究所建立的方法準(zhǔn)確、可靠，專屬性強(qiáng)，可為青娥丸的質(zhì)量控制提供參考。