張 靜,孫晶波,盛 瑜,安麗萍,杜培革,郭 笑

(北華大學(xué)藥學(xué)院,吉林吉林 132013)

樺褐孔菌[Inonotusobliquus(Pers.Fr.)Aoshi],又名白樺茸、黑樺菌、樺菌等,屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬[1-3],是生長(zhǎng)在俄羅斯、中國(guó)吉林長(zhǎng)白山以及日本北海道等寒冷地區(qū)白樺樹上的一種特殊真菌[4]。早在16世紀(jì),樺褐孔菌就被東歐一些國(guó)家用來(lái)治療胃癌、心腦血管疾病以及糖尿病等[5]。大量研究發(fā)現(xiàn),樺褐孔菌具有多種藥理學(xué)作用,包括抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎、抑菌、降糖、保肝以及免疫調(diào)節(jié)等[6-10],其中以其抗腫瘤和抗氧化活性較為突出。

黃酮類化合物(flavonoids compounds)是自然界植物中分布最廣的一類天然產(chǎn)物,存在于植物體所有部分,常以游離態(tài)存在[11],對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、開花、結(jié)果以及抵御異物侵入起重要作用[12]。黃酮類化合物具有廣泛的生物活性,它在抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、防治心腦血管疾病以及增強(qiáng)免疫力等方面都具有明顯作用[13-15]。此外,研究表明,黃酮類化合物還具有降壓、降血脂、保肝、解痙等生物活性[16-17],受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。然而目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于樺褐孔菌黃酮類化合物的研究多集中在其多糖成分,而對(duì)樺褐孔菌黃酮的研究較少。

本文利用乙醇熱回流法[18]對(duì)樺褐孔菌黃酮類化合物進(jìn)行提取,并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定,相關(guān)結(jié)果為進(jìn)一步研究樺褐孔菌黃酮及開發(fā)相應(yīng)的抗氧化食品、藥品、保健品等提供理論基礎(chǔ),也為促進(jìn)我省樺褐孔菌相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生樺褐孔菌 采摘于2015年10月,2016年3月合作單位胡慶余堂提供,經(jīng)北華大學(xué)生藥學(xué)副教授李鳳麗鑒定為野生樺褐孔菌Inonotusobliquus(Pers.Fr.)Aoshi的子實(shí)體;無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、醋酸、無(wú)水醋酸鈉、三氯化鐵、硫酸亞鐵、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、過(guò)硫酸鉀 分析純,天津市永大試劑有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) 成都普菲德生物技術(shù)有限公司;2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS,純度≥98%) 北京索萊寶科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,純度≥97.0%) 東京化工業(yè)株式會(huì)社MNEVG-T0;抗壞血酸(VC,純度≥99.7%) 天津市永大試劑有限公司;2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ,純度≥98%) 都萊生物技術(shù)有限公司R1707。

GZX-9140ME型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;ATY224型電子天平 日本島津公司;HH·S 1-Ni型電熱恒溫水浴鍋北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;UV-2550型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;infiniteM200型酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;ThermoMixer C型恒溫振蕩器 德國(guó)Eppendorf公司;FiveEasy plus 型pH儀 瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照田春蓮等[19]的硝酸鋁顯色法對(duì)梯度濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液,于510 nm處測(cè)吸光度值。以吸光度值(OD)為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品濃度(g/mL)為橫坐標(biāo),繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 黃酮類化合物的提取 取適量樺褐孔菌于恒溫鼓風(fēng)干燥箱105 ℃干燥至恒重。超微粉碎機(jī)粉碎,過(guò)60目篩。準(zhǔn)確稱取樺褐孔菌粉末,以一定質(zhì)量濃度的乙醇為提取劑一定溫度回流提取,上清液即為樺褐孔菌黃酮類化合物粗提液,收集上清液,重復(fù)2次,合并上清,70 ℃、55 r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(V)。利用硝酸鋁顯色法[17-18]測(cè)定樺褐孔菌黃酮類化合物濃縮液中的黃酮含量,計(jì)算提取率,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照。

式中:x為據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線所得測(cè)試樣樺褐孔菌黃酮類化合物濃度(g/mL);m為樺褐孔菌粉末質(zhì)量(g);V為樺褐孔菌黃酮類化合物濃縮液體積(V)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 采用1.2.2工藝提取樺褐孔菌黃酮類化合物,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察各因素變量對(duì)樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響。條件為:固定提取溫度80 ℃、提取時(shí)間1 h、乙醇濃度70%,重復(fù)2次,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對(duì)黃酮提取率的影響;固定反應(yīng)條件料液比1∶20 g/mL、提取時(shí)間1 h、乙醇濃度70%,重復(fù)2次,考察不同提取溫度(55、65、75、85、95 ℃)對(duì)黃酮提取率的影響;固定反應(yīng)條件料液比1∶20 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間1 h,重復(fù)2次,考察不同乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)對(duì)黃酮提取率的影響;固定反應(yīng)條件料液比1∶20 g/mL、提取溫度80 ℃、乙醇濃度70%,重復(fù)2次,考察不同提取時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)對(duì)黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)據(jù) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取各因素影響黃酮類化合物提取率效果最明顯的因素,采用四水平三因素L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以確定樺褐孔菌黃酮類化合物提取的最優(yōu)條件。

表1 正交因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal factor level design

1.2.5 抗氧化活性實(shí)驗(yàn) 取一定量最佳工藝條件下制備的樺褐孔菌黃酮類化合物,進(jìn)行抗氧化活性實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.1 總抗氧化能力的測(cè)定 將300 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH儀測(cè)定醋酸調(diào)pH至3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液與20 mmol/L FeCl3溶液以10∶1∶1比例混勻,制成FRAP工作液。吸取20 μL系列濃度為100、200、400、600、800、1000 μmol/L的FeSO4溶液于96孔酶標(biāo)板中,再分別加入150 μL FRAP工作液,恒溫振蕩器混勻,37 ℃靜置10 min,于593 nm讀取吸光度值。以FRAP值(即FeSO4溶液的濃度(mol/L)為縱坐標(biāo),吸光度值(OD)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[20-21]。

準(zhǔn)確吸取VC和95%乙醇配制的樺褐孔菌黃酮類化合物溶液及其稀釋液各20 μL于96孔酶標(biāo)板,各孔分別加入150 μL FRAP工作液,593 nm讀取吸光度值A(chǔ)i。以用水代替FRAP工作液的反應(yīng)液做空白(A0),VC做標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。由Ai- A0的差值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得其相應(yīng)的FeSO4濃度(mol/L),即得樺褐孔菌黃酮類化合物的總抗氧化能力(FRAP)值。

1.2.5.2 DPPH·清除率的測(cè)定 用95%乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液備用。用蒸餾水配制不同濃度(0.0050、0.0100、0.0200、0.0400、0.0800、0.1000 mg/mL)VC溶液和95%乙醇配制的不同濃度樺褐孔菌黃酮類化合物溶液適量。分別吸取100 μL VC溶液于96孔酶標(biāo)板中,再分別加入100 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液,恒溫振蕩器迅速混勻,室溫避光反應(yīng)10 min,于517 nm讀取吸光度值。同時(shí)用蒸餾水或95%乙醇做空白。以對(duì)DPPH·清除率為縱坐標(biāo),溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)繪制清除率曲線[22-23]。用VC做標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

式中,Ai:樣品溶液+DPPH溶液的吸光度值;Aj:樣品溶液+95%乙醇的吸光度值;A0:水/95%乙醇+DPPH溶液的吸光度值。

1.2.5.3 ABTS·清除率的測(cè)定 將100 mL 7 mmol/L ABTS和1.782 mL 140 mmol/L過(guò)硫酸鉀(使過(guò)硫酸鉀終濃度為2.45 mmol/L)混勻,室溫避光靜置過(guò)夜,使成ABTS·工作液。開始測(cè)量前用pH6.8的PBS緩沖液稀釋至A734=0.700±0.020。吸取40 μL系列濃度為0.0000、0.1000、0.2000、0.4000、0.6000、0.8000、1.0000 mg/mL的VC溶液和95%乙醇配制的黃酮類化合物樣品溶液于96孔酶標(biāo)板中,再分別加入160 μL ABTS·工作液,混勻,25 ℃靜置4 min,于734 nm讀取吸光度值。不加樣品的反應(yīng)液做空白;蒸餾水代替ABTS·工作液做對(duì)照。以清除率為縱坐標(biāo),濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)繪制清除率曲線[24-25]。用VC做標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

式中,Ai:VC溶液+ABTS·工作液的吸光度值;Aj:樣品溶液+蒸餾水的吸光度值;A0:水/95%乙醇+ABTS·工作液的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1得硝酸鋁顯色法線性回歸方程:y=0.01051x+0.00192,R2=0.99991。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響 不同料液比提取樺褐孔菌黃酮類化合物的結(jié)果如圖2所示,料液比為1∶10～1∶20 g/mL時(shí),提取率隨提取溶劑用量的增大而增大,料液比為1∶20時(shí)提取率最高為6.11%,之后隨提取溶劑用量的增大,由于液體量增多,濃縮時(shí)間增長(zhǎng),損失量增多,導(dǎo)致樺褐孔菌黃酮類化合物提取率降低。

圖2 料液比對(duì)樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響Fig.2 Effect ofsolid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids from Inonotus obliquus

2.2.2 提取溫度對(duì)樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響 不同溫度提取樺褐孔菌黃酮類化合物的結(jié)果如圖3所示,溫度為55～75 ℃時(shí),提取率隨提取溫度的升高而增大,溫度為75 ℃時(shí)提取率最高為9.33%,之后隨提取溫度的升高,黃酮被破壞和降解,其他可溶性雜質(zhì)析出,影響黃酮的溶解,致樺褐孔菌黃酮類化合物提取率降低。

圖3 提取溫度對(duì)樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響Fig.3 Effect of extractiontemperature on the extraction rate of flavonoids from Inonotus obliquus

2.2.3 乙醇濃度對(duì)樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響 不同乙醇濃度提取樺褐孔菌黃酮類化合物的結(jié)果如圖4所示,乙醇濃度為50%～60%時(shí),提取率隨乙醇濃度的升高而增大,乙醇濃度為60%時(shí)提取率最高,為7.29%,之后隨乙醇濃度的升高,黃酮溶解率降低,導(dǎo)致樺褐孔菌黃酮類化合物提取率降低。

圖4 乙醇濃度對(duì)樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids from Inonotus obliquus

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響 不同時(shí)間提取樺褐孔菌黃酮類化合物的結(jié)果如圖5所示,提取時(shí)間為0.5～2.0 h時(shí),提取率隨時(shí)間的增大而增大,提取時(shí)間為2.0 h時(shí)提取率最高為10.65%,之后隨時(shí)間的增大,致已經(jīng)溶解的黃酮被藥渣反吸,使樺褐孔菌黃酮類化合物提取率逐漸降低。

圖5 提取時(shí)間對(duì)樺褐孔菌黃酮類化合物提取率的影響Fig.5 Effect of extractiotime on extraction rate of flavonoids from Inonotus obliquus

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

由表2方差結(jié)果可知,各因素對(duì)樺褐孔菌黃酮類化合物提取率影響的大小順序?yàn)镃>B>D>A,即提取溫度>乙醇濃度>提取時(shí)間>料液比。由K值可知,優(yōu)化工藝組合為A3B2C2D2,而正交實(shí)驗(yàn)提取率最高組合為A1B2C2D2,故將兩組分別進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。其中A3B2C2D2組合的平均提取率為10.66%±0.17%,A1B2C2D2組合的平均提取率為10.62%±0.33%,證明樺褐孔菌黃酮類化合物提取率最優(yōu)條件為正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝組合A3B2C2D2,即料液比1∶25 g/mL,乙醇濃度60%,提取溫度75 ℃,提取時(shí)間2.0 h。

表2 樺褐孔菌黃酮類化合物熱回流法正交實(shí)驗(yàn)Table 2 Orthogonal experiment of hot reflux method of flavonoids from Inonotus obliquus

2.4 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 總抗氧化能力的測(cè)定 由圖6得線性回歸方程:y=850.28176x-2.35817,R2=0.99996。由圖7得線性回歸方程:y=0.01171x-0.00112,R2=0.99994。經(jīng)計(jì)算,200 μg/mL時(shí),VC的吸光度(OD)為2.34,樺褐孔菌黃酮類化合物的OD值為0.55,兩者的FRAP值分別為1988.05、464.53 μmol/L,即樺褐孔菌黃酮類化合物還原能力相當(dāng)于VC的0.23倍。

圖6 FeSO4的總抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of FeSO4

圖7 VC的總抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of VC

2.4.2 DPPH·清除率的測(cè)定 由圖8可知,VC和樺褐孔菌黃酮類化合物對(duì)DPPH· 的清除能力均隨著樣品質(zhì)量濃度的增大而增大,其EC50分別為28.95和36.44 μg/mL。樺褐孔菌黃酮類化合物對(duì)DPPH·清除能力略弱于VC,但二者對(duì)DPPH·的清除能力均能達(dá)到80%以上。EC50越小,抗氧化能力最強(qiáng)。說(shuō)明樺褐孔菌黃酮類化合物對(duì)DPPH·存在良好的清除能力。

圖8 VC和樺褐孔菌黃酮類物質(zhì)對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.8 Effects of VC and flavonoids from Inonotus obliquus on DPPH free radicals clearance

2.4.3 ABTS·清除率的測(cè)定 由圖9可知,VC和樺褐孔菌黃酮類化合物對(duì) ABTS·的清除能力均隨著樣品質(zhì)量濃度的增大而增大,其EC50分別為235.68和299.89 μg/mL。樺褐孔菌黃酮類化合物對(duì)ABTS·清除能力略弱于VC,但二者對(duì)ABTS·的清除能力均能達(dá)到90%以上。說(shuō)明樺褐孔菌黃酮類化合物對(duì)ABTS·存在良好的清除能力。

圖9 VC和樺褐孔菌黃酮類物質(zhì)對(duì)ABTS·清除率的影響Fig.9 Effects of VC and flavonoids from Inonotus obliquus on ABTS free radicals clearance

3 結(jié)論

該研究利用乙醇熱回流法對(duì)野生樺褐孔菌進(jìn)行提取。在溫度75 ℃,乙醇濃度60%,提取時(shí)間2.0 h,料液比1∶25 g/mL條件下提取黃酮類化合物含量最高為53.25 mg/mL,提取率為10.66%±0.17%,對(duì)樺褐孔菌黃酮類化合物的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗氧化能力:其FRAP值相當(dāng)于VC的0.23倍;對(duì)DPPH·清除率達(dá)80%以上;對(duì)ABTS·清除率達(dá)90%以上。

綜上所述,樺褐孔菌中黃酮類化合物含量豐富,且有較強(qiáng)的抗氧化活性,有望作為天然抗氧化劑被廣泛應(yīng)用,本研究為樺褐孔菌黃酮的開發(fā)及應(yīng)用奠定了良好的理論基礎(chǔ)。