李 智,黃曉山,鄭寶東,2,*,鄧凱波

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350000;2.福建省海洋資源綜合加工及安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工程技術(shù)研究中心,福建福州 350000;3.中國(guó)愛爾蘭國(guó)際合作食品物質(zhì)學(xué)與結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)研究中心,福建福州 350000)

海參被譽(yù)為“海產(chǎn)八珍”之首,在我國(guó)具有悠久的養(yǎng)殖和食用歷史[1]。2013至2016年,福建海參產(chǎn)量年均增長(zhǎng)14.1%[2]。產(chǎn)業(yè)規(guī)模的急速擴(kuò)張帶來的養(yǎng)殖密度過高、水質(zhì)不穩(wěn)定等問題,導(dǎo)致海參染病率增加問題凸顯[3],且南北方養(yǎng)殖環(huán)境差異明顯,傳統(tǒng)的廣譜抗生素和化學(xué)藥物濫用現(xiàn)象嚴(yán)重制約了海參產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展[4-5]。而微生態(tài)制劑通過向飼料中添加活性微生物維持腸道平衡來改善宿主狀態(tài),益生菌能與宿主、環(huán)境之間形成動(dòng)態(tài)平衡,有利于宿主的健康生長(zhǎng)[6-7],是一種綠色無污染的新型疾控手段。利用內(nèi)源性益生菌較強(qiáng)的抗養(yǎng)殖環(huán)境脅迫能力和海參體內(nèi)定植能力優(yōu)勢(shì),將有效提高其抗病效果。目前,有關(guān)海參微生物菌群分析的報(bào)道僅局限于遼寧、河北、山東等北方養(yǎng)殖地區(qū)[8]。近年來,國(guó)內(nèi)海參養(yǎng)殖呈現(xiàn)“北參南養(yǎng)”的局面,福建是南方的主產(chǎn)區(qū),針對(duì)福建海參微生物群落結(jié)構(gòu)的研究和內(nèi)源益生菌的開發(fā)具有重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

芽孢桿菌是一種微生態(tài)制劑的重要來源菌,其中枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是中國(guó)農(nóng)業(yè)部公布的12種飼料級(jí)微生物添加劑之一[9],而解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的研究表明其部分抗菌活性物質(zhì)與枯草芽孢桿菌相似[10-11]。抗菌脂肽為芽孢桿菌中最常見的抑菌物質(zhì),主要為表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)與豐原素(Fengycin)[12-15]?？咕膶?duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、霉菌以及酵母菌均有抑制作用,具有抗菌范圍廣、安全高效、易降解、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)[16-18]。因此,抗菌脂肽在農(nóng)業(yè)、食品、生物防治等領(lǐng)域顯示出重要的開發(fā)和應(yīng)用前景[19-20]。Meen等[21]研究發(fā)現(xiàn),Iturin和Fengycin對(duì)病原真菌生長(zhǎng)起抑制作用,而Surfactin具有廣泛有效的抑菌活性。馬樹瑞等[22]從海參腸道中篩選出枯草芽孢桿菌HS-A38,從該菌株發(fā)酵液提取的粗品中分離出兩種直鏈脂肽類化合物,對(duì)致病菌有明顯抑制作用,但并未明確脂肽化合物的具體成分。田良等[23]研究發(fā)現(xiàn),以海參消化道提取出的芽孢桿菌X3-3、X4-1及X4-5作為海參飼料添加劑,可顯著提高海參消化道內(nèi)淀粉酶與蛋白酶活性,促進(jìn)海參生長(zhǎng),但并未分離確定其功效成分。

因此,本研究擬采用16S rDNA序列比對(duì)和生物群落豐度分析手段研究福建海參腸道內(nèi)源微生物,并以對(duì)海參致病菌的抑菌譜和抑菌能力為評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選其中的潛在益生菌,對(duì)提取的抗菌脂肽類物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)分析,以探明其抑菌機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成年海參 取樣自福建省寧德市霞浦海參養(yǎng)殖場(chǎng);2216E培養(yǎng)基:蛋白胨5.0 g,酵母膏1.0 g,磷酸高鐵0.1 g,陳海水1000 mL;2216E固體培養(yǎng)基另加15 g瓊脂;抽提細(xì)菌基因組DNA試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;硅膠板(Si60 F254) 默克化工技術(shù)(上海)有限公司;表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)、豐原素(Fengyci) 標(biāo)準(zhǔn)品,美國(guó)Amresco公司。

BSA224S型分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SPX-250型號(hào)恒溫培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;Allegra X-30R Centrifuge高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫爾特有限公司;GI100DS型高壓滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司;DHG-9145A型鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;FDU-1200型冷凍干燥機(jī) 上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海參腸道菌群的分離純化 將取自福建霞浦養(yǎng)殖場(chǎng)的成年海參20只分為兩組,S1組為10只健康成年海參,S2組為10只體表病灶相似、質(zhì)地松軟的病參的成年海參(圖1)。無菌條件下,75%(v/v)乙醇溶液擦拭體表后,用手術(shù)刀劃開海參體表取出整段腸道,無菌生理鹽水(0.9%(w/v)NaCl溶液)擦拭腸道外壁。然后將腸道剪碎后放入滅菌研缽,加入少量4 ℃的無菌生理鹽水研磨均勻。取研磨后的混合物倒入裝有2216E液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,27 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4 d。吸取1 mL混勻的培養(yǎng)物,使用無菌生理鹽水做梯度稀釋后,涂布于固體2216 E海水固體培養(yǎng)基上,每個(gè)梯度做三個(gè)平行,將涂布的平板放入27 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色及大小差異挑取菌落,分別在2216E固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),對(duì)海參腸道菌株進(jìn)行分離純化,并分別與甘油混合置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 海參腸道菌株16S rDNA測(cè)序及菌株多樣性分析 取純化后菌株活化后,采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取各菌株基因組DNA,并采用27F和1492R引物進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增,經(jīng)回收純化后將目標(biāo)序列送至鉑尚生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。然后將拼接好的16S rDNA序列提交至NCBI(National Center for Biotechnology Information)的GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastn比對(duì)及同源性鑒定。采用ClustalW軟件進(jìn)行多序列匹配排列,MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并對(duì)潛在益生菌及致病菌進(jìn)行多樣性分析。

1.2.3 海參腸道內(nèi)潛在益生菌的體外抑菌實(shí)驗(yàn) 采用牛津杯法[24]進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn),選取海參腸道內(nèi)提取出的8株典型致病菌為指示菌,以其潛在益生菌為拮抗菌。將2個(gè)滅菌牛津杯置于均勻涂布了0.6 mL指示菌菌懸液(OD600=0.3)的2216E固體培養(yǎng)基上后,在其中一個(gè)牛津杯中加入200 μL的新鮮拮抗菌菌懸液(OD600=0.6),另一個(gè)牛津杯中加入200 μL的無菌生理鹽水做空白對(duì)照。將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.4 海參腸道內(nèi)潛在益生菌的抗菌脂肽類化合物提取 采用酸沉淀法[]提取篩選后抗致病菌的益生菌內(nèi)的脂肽類化合物。將新鮮的細(xì)菌發(fā)酵液在4 ℃下10000 r/min離心20 min,上清液用6 mol/L HCl調(diào)pH至2.0,放置于4 ℃冰箱過夜,10000 r/min離心20 min棄上清后,加適量甲醇對(duì)沉淀進(jìn)行充分溶解,靜置0.5 h后10000 r/min離心10 min,上清液用微孔濾膜(D=0.22 μm)過濾后,置于60 ℃烘箱中至大部分甲醇揮發(fā),對(duì)樣品進(jìn)行凍干處理,得到脂肽類化合物的粗提物。

1.2.5 脂肽類粗提物對(duì)海參腸道典型致病菌的生長(zhǎng)抑制作用 選取2株海參腸道內(nèi)典型致病菌,以10%(v/v)的接種量接入100 mL 2166E液體培養(yǎng)基中,混合均勻后取10 mL培養(yǎng)液分別加入若干無菌空試管中。將提取出的脂肽類粗提物分別用甲醇稀釋至1 mg/mL制成粗提物溶液,分別取500 μL粗提物溶液加入上述致病菌培養(yǎng)液試管中,并以甲醇做空白對(duì)照,硅膠塞封口后于28 ℃中振蕩(110 r/min)培養(yǎng)12 h。使用比濁法測(cè)定菌液濃度,取0、1.5、4、6.5、9和12 h的菌懸液,在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定菌懸液的吸光光度值。以其OD600值為縱坐標(biāo),培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制生長(zhǎng)抑制曲線。

1.2.6 抗菌脂肽粗提物薄層色譜(Thin-layer chromatography,TLC)分析 根據(jù)莊國(guó)宏[26]方法并稍作修改,將硅膠板置于110 ℃烘箱中活化30 min并確定點(diǎn)樣線后,在層析缸內(nèi)加入層析劑(三氯甲烷∶甲醇∶冰醋酸∶水=65∶15∶5∶2 (v/v/v))預(yù)展30 min。用少量甲醇溶解脂肽粗提物樣品及標(biāo)準(zhǔn)品,毛細(xì)管蘸取樣品在點(diǎn)樣線上點(diǎn)樣,兩樣品間距1.5 cm,待點(diǎn)樣處干燥后置于層析缸中展開,至硅膠板上端距離約1 cm處為展開終點(diǎn)。色譜結(jié)束后,將硅膠板置于裝有2 mL濃鹽酸(37.5%(v/v)HCl溶液)的小燒杯的密閉容器內(nèi),110 ℃烘箱中酸解2 h,取出后,硅膠板冷卻,將鹽酸吹凈,噴灑0.4%(v/v)茚三酮顯色劑,放入110 ℃烘箱中15 min進(jìn)行顯色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)均為三次重復(fù)結(jié)果,并采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行顯著性分析,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參內(nèi)源菌株分離純化

將稀釋的種子培養(yǎng)混合物涂布于2216E平板培養(yǎng)基上并培養(yǎng)3 d后,通過肉眼和光學(xué)顯微鏡觀察菌落形狀、顏色、透明度、聚落等情況。從平板上挑選生長(zhǎng)良好,未染雜的且具備一定差異性的菌落,將其進(jìn)行平板劃線培養(yǎng),純化后分別保存。本研究從海參腸道中分離純化共95株優(yōu)勢(shì)菌株。

2.2 菌株16S rDNA鑒定與微生物群落結(jié)構(gòu)分析

將95株優(yōu)勢(shì)菌株的16S rDNA序列通過PCR手段擴(kuò)增并純化后測(cè)序,使用16S rDNA,得到各菌株的拼接序列。將其提交到NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blastn比對(duì),根據(jù)序列相似性(>95%)確定菌株種屬。95株優(yōu)勢(shì)菌株中,共分離出潛在益生菌31株,潛在致病菌株37株及普通腸道菌27株。并在屬水平上對(duì)健康參組(S1)和病參組(S2)中進(jìn)行腸道附生微生物群落結(jié)構(gòu)比較分析(見圖2)。

如圖2所示,從兩組海參腸道樣本中挑選的菌株由11個(gè)細(xì)菌屬組成,分別為芽孢桿菌屬(Bacillus)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、海單胞菌屬(Marinomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、海桿菌屬(Marinobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、假海源菌屬(Pseudidiomarina)、弧菌屬(Vibrio)和Oceanisphaera菌屬。在S1中,以芽孢桿菌屬和假單胞菌屬豐度最高,分別占菌株總數(shù)的36.96%和17.39%;在S2中,以假交替單胞菌屬和芽孢桿菌屬豐度最高,分別占菌株總數(shù)的30.61%和28.57%;S1中的海桿菌屬在S2中并未發(fā)現(xiàn),S2中的弧菌屬和假海源菌屬在S1中并未發(fā)現(xiàn);同時(shí),S2中假交替單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬的豐度遠(yuǎn)高于S1。其中,芽孢桿菌屬被公認(rèn)多為海參生長(zhǎng)潛在益生菌,并廣泛用于微生態(tài)制劑開發(fā)中[23];有報(bào)道指出,假交替單胞菌屬、弧菌屬、不動(dòng)桿菌屬、海桿菌屬和假單胞菌屬為海參潛在致病菌[27]。因此可見病參組中潛在致病菌豐度較高,而芽孢桿菌豐度較健康參組低。本研究海參樣品的微生物群落僅包含11個(gè)可檢測(cè)菌屬,與其他相關(guān)報(bào)道[27]中菌屬數(shù)量相比相對(duì)較少,這可能與樣品養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)。樣品取自福建霞浦吊籠養(yǎng)殖場(chǎng),海參生活環(huán)境、飼料組分及微生態(tài)制劑的使用都會(huì)對(duì)海參腸道內(nèi)微生物的組成產(chǎn)生影響[28]。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)福建養(yǎng)殖刺參與北方海參腸道優(yōu)勢(shì)菌群具有一定差異。張文姬等從大連地區(qū)仿刺參腸道分離得到的細(xì)菌中,共有10個(gè)菌屬,優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬、弧菌屬和芽孢桿菌屬,分別占總菌株數(shù)的33.3%、24.8%和22%;Zhang等[27]從日本海域刺參、底泥及海水中分離得到53個(gè)菌屬共計(jì)1133種菌株,分別屬于厚壁菌門、變形菌門及放線菌門,但并未分離到弧菌屬。

2.3 海參內(nèi)源潛在益生菌的體外抑菌作用分析

根據(jù)2.2中S1組與S2組的微生物群落結(jié)構(gòu)差異,選取不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬和海桿菌屬等3個(gè)屬共8株海參潛在致病菌為指示菌。其中,不動(dòng)桿菌屬在病參組的含量高于健康參組,海桿菌屬、惡性假單胞菌(假單胞菌屬)為海參致病菌之一[27,29]。對(duì)海參內(nèi)源潛在益生菌進(jìn)行抑菌能力初篩后,選取10株以芽孢桿菌為代表的典型益生菌作為拮抗菌株,采用牛津杯法對(duì)其體外抑菌能力進(jìn)行測(cè)評(píng)(表1)。

表1 福建海參內(nèi)源益生菌對(duì)致病菌的抑菌作用Table 1 Bactriostasis of endogenous probiotics on pathogens of Fujian sea cucumber

以抑菌圈平均直徑和抑菌譜為雙重指標(biāo),對(duì)各拮抗菌株的抑菌能力比較可知,抑菌種數(shù)達(dá)到5株及以上的典型益生菌共有四株,分別為YD1、YK5、YK7和YY8,其中YK7和YY8的抑菌圈平均直徑僅為11.76和11.22 mm,抑菌效果相對(duì)較差。而YK9的抑菌圈平均直徑雖達(dá)13.95 mm,但抑菌種數(shù)僅為3株,抑菌譜較窄。因此,綜合比較篩選出海參附生芽孢桿菌YD1和YK5的相對(duì)抑菌能力較強(qiáng),對(duì)各指示菌的抑菌圈形態(tài)見圖3。

圖3 內(nèi)源益生菌YD1和YK5對(duì)海參致病菌抑制作用的抑菌圈展示Fig.3 Illustration of inhibition zone of endogenous probiotics YD1 and YK5 on pathogens from Fujian Apostichopus japonicus

經(jīng)16S rDNA序列擴(kuò)增及測(cè)序確定YD1和YK5分別為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(圖4)。

圖4 福建海參內(nèi)源芽孢桿菌YD1 和YK5種屬鑒定系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of endogenous Bacillus YD1 and YK5 from Fujian Apostichopus japonicus注:采用MEGA 7.0軟件基于Tamura-Nei模型的 最大似然法作樹,Bootstrap value=500。

2.4 內(nèi)源芽孢桿菌YD1和YK5脂肽類粗提物對(duì)典型致病菌的生長(zhǎng)抑制作用

提取具有較強(qiáng)抑菌能力的解淀粉芽孢桿菌YD1和枯草芽孢桿菌YK5的脂肽類化合物,并對(duì)粗提物的抑菌作用進(jìn)行對(duì)比研究,以本研究分離的典型致病菌惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)ZE4和ZE5為指示菌,以甲醇為空白對(duì)照組,抑菌結(jié)果如圖5所示。與甲醇對(duì)照組結(jié)果比較,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),從9 h開始,ZE4菌懸液的OD600值呈現(xiàn)出顯著差異(p<0.05)(圖5A和5C),YD1和YK5的脂肽提取物對(duì)ZE4的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用;從6.5 h開始,ZE5菌懸液的OD600值呈現(xiàn)出顯著差異(p<0.05)(圖5B和5D),YD1與YK5的脂肽提取物對(duì)ZE5的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用。結(jié)果顯示,雖然抑菌效果有差異,但YD1和YK5的脂肽類粗提物對(duì)ZE4及ZE5的生長(zhǎng)均具有抑制作用。該結(jié)果表明,解淀粉芽孢桿菌YD1和枯草芽孢桿菌YK5的脂肽類代謝產(chǎn)物有抑制致病指示菌生長(zhǎng)的效果。

圖5 內(nèi)源性益生菌脂肽類粗提物對(duì)致病菌的生長(zhǎng)抑制作用Fig.5 Growth inhibition effects of lipopeptide extraction of endogenous probiotics on pathogens注:(A)、(C)為以ZE4為指示菌,(B)、(D)為以ZE5為指示菌;“*”表示與同時(shí)間空白組 結(jié)果差異顯著(p<0.05);“**”表示與同時(shí)間空白組結(jié)果差異極顯著(p<0.01)。

2.5 薄層色譜(TLC)分析

由芽孢桿菌YD1和YK5脂肽類代謝產(chǎn)物的薄層色譜結(jié)果可知(圖6),使用茚三酮對(duì)硅膠板進(jìn)行噴灑染色并放入烘箱烘干后,YD1和YK5在對(duì)應(yīng)位置處(點(diǎn)A)均呈現(xiàn)為單一的褐色斑點(diǎn),樣品與標(biāo)準(zhǔn)品Surfactin的相對(duì)遷移率Rf基本一致(Rf=0.75)。Fengycin、Iturin與Surfactin的相對(duì)分子質(zhì)量均在1000～1500范圍內(nèi)[30],Fengycin和Iturin標(biāo)準(zhǔn)品也在A處附近呈現(xiàn)明顯的褐色斑點(diǎn),說明其相對(duì)遷移率與Surfactin及樣品脂肽的基本一致?？沙醪秸J(rèn)定兩菌株的代謝產(chǎn)物含有Fengycin、Iturin、Surfactin中的一種或多種脂肽類物質(zhì),且均為含有親水性成分的環(huán)脂肽類化合物[31]。

圖6 芽孢桿菌YD1和YK5脂肽類代謝產(chǎn)物TLC結(jié)果Fig.6 Thin-layer chromatogram of lipopeptides metabolized by Bacillus YD1 and YK5

3 結(jié)論

本研究從福建海參腸道中提取95株優(yōu)勢(shì)菌株,其中,共分離出潛在益生菌31株,潛在致病菌株37株及普通腸道菌27株。通過微生物群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),病參腸道中假交替單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬等典型致病菌豐度較高,芽孢桿菌豐度較低,是正常組海參與患病組海參的主要差異,可能是導(dǎo)致福建海參疾病的原因之一。

使用牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn),以抑菌能力為指標(biāo)篩選出兩株抑菌效果明顯且抑菌譜較廣的菌株,經(jīng)16S rDNA測(cè)序及比對(duì)確定其為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)YD1和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)YK5。研究了上述兩株芽孢桿菌的脂肽類代謝產(chǎn)物對(duì)海參內(nèi)源致病菌的抑菌作用,發(fā)現(xiàn)其對(duì)致病菌生長(zhǎng)均有良好的抑制作用,證明了其抑菌機(jī)理與脂肽類化合物有關(guān),且為含有親水性成分的環(huán)脂肽類化合物。

本研究對(duì)構(gòu)建新型益生菌,開發(fā)新型微生態(tài)制劑以及海參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康,可持續(xù)發(fā)展提供了重要的理論依據(jù)。