李林，周虹，唐忠海，蘇小軍,3，李清明，郭時印

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南長沙 410128）（2.湖南農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，湖南長沙 410125）（3.湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點實驗室，湖南長沙 410128）

現(xiàn)有研究報道，1-脫氧野尻霉素(DNJ)由于其結(jié)構(gòu)與葡萄糖相似，可競爭性抑制糖苷酶活性，從而顯著降低多糖的降解水平，現(xiàn)有關于DNJ的研究集中分離提取工藝的優(yōu)化、提取物生物活性和物理化學性質(zhì)的研究[1]。DNJ同時與糖尿病相關的五種酶作用的機制尚未見報道，在相互作用機制沒得到合理闡述之前，傳統(tǒng)的體外篩選試驗往往具有很大盲目性與隨機性，成本較高，也將影響DNJ在食品或藥品中的開發(fā)及利用。

分子對接是將配體分子置于受體分子的活性位點附近，搜索分子自身的構(gòu)象和位置，得到與分子間相互作用的最佳匹配模式。目前已經(jīng)廣泛應用于小分子與蛋白結(jié)合模擬方面，在候選藥物活性化合物的發(fā)現(xiàn)及其與靶標的結(jié)合方式方面已經(jīng)得到認可[2]。分子動力學模擬方法是一種具有確定性的模擬方法，其通過求解一組原子運動方程得到整個體系的相空間運動軌跡，再利用統(tǒng)計學方法得到其宏觀性質(zhì)。分子對接是從整體上考慮配體小分子與受體大分子（生物大分子）的結(jié)合情況，在一定程度上能有效地防止不同方式里部分作用稍好但整體效果不完善這種高頻出現(xiàn)的尷尬現(xiàn)象。其科學性及確定性越來越受到科研工作者的青睞[3]。另外有很多研究者感興趣但目前的條件無法進行的實驗也能通過計算得以完成，比如分子動力學模擬可以在納秒級對分子行為進行分析。

但是分子對接這項技術的缺陷也十分明顯，在分子對接體系中，我們在很多情況下默認小分子和生物大分子進行的是剛性對接即不考慮分子的振動轉(zhuǎn)動等因素對配體與受體結(jié)合的影響，而實際環(huán)境中小分子配體和生物大分子都是處于一個不斷變化的過程中，所以還需要借助分子動力學更好地模擬小分子配體和生物大分子的最真實的模擬情況?；诖?，本試驗采用分子對接和分子動力學模擬方法，從 PTP1B、PPARα、PPARγ、α-淀粉酶（α-Amylase）和α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase）等蛋白中確定了DNJ的作用靶標，并闡明其作用模式。

1 計算方法

1.1 分子對接

分子對接的準備工作均在 UCSF Chimera[4]中進行。首先，從RCSB Protein Data Bank上下載PTP1B、PPARα、PPARγ、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)（PDB編號：4Y14、5HYK、3U9Q、4GQR和3WY2，分辨率：1.90?、1.83?、1.52?、1.20?和1.47?）。去除蛋白晶體中多余肽鏈和溶劑小分子，除PPARγ保留A、B兩鏈外，其他蛋白均保留A鏈。配體分子1-脫氧野尻霉素的三維結(jié)構(gòu)下載自PubChem。然后，采用DockPrep模塊為蛋白添加氫原子，為蛋白和配體分子分別添加AMBERff4SB力場和AM1-BCC電荷[5,6]，并對配體分子進行了充分的能量優(yōu)化。接著，采用DMS工具以半徑為 1.4?的探針生成受體的分子表面，以晶體中的配體化合物所在位置為對接口袋，使用 sphgen模塊生成圍繞活性位點的球狀集合（Spheres），選擇距離活性位點中心8?以內(nèi)的球集，包圍球集的盒子大小設為12?×12?×12?。使用DOCK 6.7[7,8]軟件包的Grid程序生成用于能量打分的Grid文件。在本對接研究中，采用半柔性對接方法（即配體分子的構(gòu)象可發(fā)生變化，蛋白受體的結(jié)構(gòu)保持剛性），為各體系分別生成10000個不同的分子構(gòu)象取向，計算配體分子與結(jié)合位點的靜電力和范德華力貢獻，加和得到Grid打分。經(jīng)過聚類分析（RMSD截斷值為2.0?，避免生成冗長多余構(gòu)象），得到若干打分最佳的對接構(gòu)象。采用人工分析方法，從各體系中選取一個最佳構(gòu)象用于分子動力學模擬。

1.2 分子動力學模擬

選取各體系打分最佳的構(gòu)象（構(gòu)象 1）作為分子動力學模擬的初始結(jié)構(gòu)，所有準備和模擬工作均在Amber14和AmberTools15[9]中進行。采用tLeap工具為受體蛋白和配體小分子分別添加AMBERff14SB和GAFF力場，小分子采用AM1-BCC方法計算的電荷。然后，體系采用TIP3P水模型，水箱大小為10?，添加抗衡離子（counter ions）使體系接近電中性。經(jīng)過以下步驟使體系達到平衡：（1）2000步能量優(yōu)化：復合物原子添加約束力100 kcal/(mol·?2)，其中前面800步采用最陡下降法，然后共軛梯度法進行之后 1200步的優(yōu)化；（2）3000步能量優(yōu)化：受體重原子添加約束力50 kcal/(mol·?2)，前面1000步采用最陡下降法，接著2000步采用共軛梯度法；（3）8000步能量優(yōu)化：不加約束力，前面2000步最陡下降法，接著6000步采用共軛梯度法；（4）50 ps的加熱相：受體和配體全部原子添加約束力100 kcal/(mol·?2)，最終溫度為298 K；（5）50 ps平衡相：受體和配體全部原子添加約束力50 kcal/(mol·?2)，采用NPT系綜（isothermal is obaric ensemble）；（6）100 ps平衡相：受體和配體全部原子加約束力50 kcal/(mol·?2)，采用NPT系綜。但考慮到計算代價，對各個體系僅進行1ns的NPT系綜動力學模擬，采用朗之萬動力學（Langevin dynamics）方法控制體系溫度，設定碰撞頻率（collision frequency）為10 ps-1，所有形成共價鍵的氫原子采用SHAKE[10]算法加以約束，遠程靜電相互作用（long range electrostatic interactions）采用 Particle Mesh Ewald（PME）[11]方法進行處理，范德華相互作用（vander Waals interactions）截斷值設為10?。采用MM/GBSA[12]方法計算結(jié)合自由能。

出于計算資源成本與計算結(jié)果精度的考慮，首先采用Amber14為各體系進行1ns的分子動力學模擬，通過結(jié)合自由能計算，確定DNJ的潛在作用靶標，然后，對該體系進行20 ns的分子動力學模擬，利用氫鍵分析和能量分解手段，闡明其相互作用模式及降血糖作用的分子機制。

2 計算結(jié)果

2.1 分子對接結(jié)果

采用DOCK6.7預測配體小分子DNJ與PTP1B、PPARα、PPARγ、α-淀粉酶（α-Amylase）和α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase）等蛋白的結(jié)合模式，經(jīng)過聚類計算，各自得到2～4個對接構(gòu)象，打分情況如表1所示

表1 配體小分子DNJ與各受體蛋白的對接打分（kcal/mol）Table 1 Scores of DNJ docking with the proteins

對接構(gòu)象的Grid Score總打分在-41～-30 kcal/mol之間，盡管靜電力貢獻 Grid_es差異相對較大，但同一體系的對接構(gòu)象之間的范德華力貢獻 Grid_vdw差別不大，因而構(gòu)象間Grid Score總打分差別不大。這是因為小分子DNJ結(jié)構(gòu)簡單且體積小，可變構(gòu)象少，導致它與各蛋白的接觸面積較小，疏水作用不明顯。經(jīng)分析，在各蛋白口袋中，DNJ各對接構(gòu)象的取向和結(jié)合方式較為接近，因此，選取打分最佳的對接構(gòu)象（構(gòu)象1）用于后續(xù)研究。

2.2 分子動力學模擬

2.2.1 RMSD分析

為了解體系動力學過程的穩(wěn)定性以及結(jié)合自由能取樣的合理性，使用 Cpptraj模塊對動力學骨架進行RMSD分析。體系動力學平衡階段的第一個構(gòu)作為RMSD的參照構(gòu)象，只考慮蛋白的骨架原子（CA、C和N原子）和配體分子的重原子。

RMSD的變化顯示了體系整體結(jié)構(gòu)的波動情況。如表所示，各體系整體和蛋白自身在經(jīng)歷短暫的時間后迅速達到平穩(wěn)，DNJ小分子的RMSD在PPARα-DNJ體系中500 ps附近出現(xiàn)了跳躍，然后立即進入新的平臺。檢查結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該微小的跳躍（小于0.5 ?）是由于DNJ小分子輕微的構(gòu)象調(diào)整，由于形成新的氫鍵而立即穩(wěn)定下來。因此，各體系已達到平衡狀態(tài)，可進行后續(xù)分析。

2.2.2 結(jié)合自由能計算

Amber14中結(jié)合自由能是通過對分子動力學軌跡進行定點采樣統(tǒng)計得到的平均值。

在本研究中，對整個平衡階段1 ns的動力學軌跡進行采樣，選取200幀，采用MM/GBSA方法進行結(jié)合自由能計算。出于計算成本的考慮，結(jié)合自由能計算中并未考慮熵的貢獻。然而，由于DNJ小分子為一小環(huán)結(jié)構(gòu)，結(jié)合前后自身構(gòu)象變化不大，蛋白受體也未見發(fā)生較明顯的蛋白運動，因此，熵對結(jié)合力計算影響不大。

圖1 各體系1ns分子動力學軌跡的RMSD分析Fig.1 RMSD analysis of 1ns molecular dynamic track of every systerm

如圖1所示，PTP1B、PPARα、PPAPγ、α-Amylase和α-Glucosidase這5個體系的結(jié)合自由能計算值分別為-24.66 kcal/mol、-25.04 kcal/mol、-21.65 kcal/mol、-21.84 kcal/mol和-35.76 kcal/mol。DNJ小分子與α-Glucosidase的結(jié)合力顯著大于其他體系，提示DNJ小分子極有可能作用于α-Glucosidase。而自由能較小的其他蛋白，則可能不是DNJ小分子的靶標。分析能量項可知，在形成復合物的過程中，范德華力作用、靜電力作用和非極性溶劑化能均為負值，有利于復合物結(jié)合；而極性溶劑化能則為正值，對復合物的形成有阻礙作用。α-Glucosidase復合物的范德華力貢獻在5個體系中偏低，但靜電力貢獻很好地彌補了這一不足。因此，靜電力作用是DNJ小分子與α-Glucosidase蛋白結(jié)合的主要驅(qū)動因素，這與其小體積的極性結(jié)構(gòu)特點相一致。

表1 各體系的結(jié)合自由能（kcal/mol）Table 2 Free Combined energy of every systerm (kcal/mol)

2.2.3 能量分解

圖2 α-Glucosidase-DNJ體系20 ns分子動力學軌跡的RMSD分析Fig.2 RMSD analysis of 20 ns molecular dynamic track of 2α-glucosidase-DNJ systerm

圖3 α-Glucosidase與DNJ小分子結(jié)合的關鍵相互作用Fig.3 Important interactions between α-glucosidase and DNJ

圖4 α-Glucosidase與DNJ小分子的結(jié)合模式Fig.4 Combining mode of α-glucosidase with DNJ

根據(jù)結(jié)合自由能計算結(jié)果，推測α-Glucosidase是DNJ小分子的靶標。為深刻理解它們的相互作用模式以及更具體地分析作用的選擇性問題，對該體系增加20 ns的動力學模擬，并對體系進行能量分解，采用MM/GBSA方法計算所有殘基的貢獻。

為考察體系在長時間模擬中是否發(fā)生較大的構(gòu)象變化，進行了RMSD分析。結(jié)果表明（圖2），蛋白骨架原子經(jīng)過約3 ns的運動調(diào)整后，達到長時間的平衡。DNJ分子在3 ns時發(fā)生了較明顯的構(gòu)象變化，并維持至10 ns，但之后恢復到原來的構(gòu)象，并最終達到平衡，一直維持到模擬結(jié)束。因此，截取10 ns后的軌跡進行聚類分析、氫鍵分析和結(jié)合自由能相關計算。

能量分解結(jié)果表明（圖3 ），Glu271、Asp333和Asp202在DNJ與α-Glucosidase結(jié)合中作用明顯。其他殘基，如His332、Asn331也對復合物的形成做出正向貢獻，而Asp62則不利于復合物的形成。對于DNJ和α-Glucosidase的復合物，范德華力和非極性溶劑化能的貢獻很小，上述重要殘基的結(jié)合力貢獻主要來自靜電力作用和極性溶劑化能，但兩者發(fā)生一定程度的抵消。

Asp202中的羧基帶負電，與 DNJ小分子的 O1羥基之間存在很大的靜電吸引力，真空靜電作用能為-8.12±1.54 kcal/mol，但極性溶劑化能為 6.91±1.44 kcal/mol；氫鍵分析表明，兩者之間形成一個平均長度2.76 ?，鍵角159.55°的氫鍵，占有率達98.14%，非常穩(wěn)定。Glu271的羧基與DNJ的O2和O3分別形成2個氫鍵作用，鍵長 2.68? 和 2.74?，鍵角 164.83°和158.35°，占有率89.22%和105.05%（表明在模擬過程中，羧基發(fā)生旋轉(zhuǎn)，存在O3原子同時與羧基的兩個氧原子形成氫鍵的情況）。因此，其靜電力貢獻最大，達到-15.85 kcal/mol，極性溶劑化能雖然也增大不少，綜合而言，總結(jié)合力貢獻也為最大（-3.86 kcal/mol）。Asp333的羧基O原子同時與DNJ的羥基O原子和N原子形成氫鍵作用，鍵長 2.67? 和 2.866 ?，鍵角162.38°和161.17°，占有率96.55%和74.05%。

表2 采用MM/GBSA方法進行能量分解的主要貢獻殘基各部分能量值（kcal/mol）Table 3 The energy value of the main residues analysised with MM/GBSA methord (kcal/mol)

這為DNJ分子的結(jié)合提供了-9.80±1.60 kcal/mol的靜電力作用，由于極性溶劑化能的抵消作用，總結(jié)合自由能貢獻為-2.95±1.20 kcal/mol。Asp62的靜電力作用為正值，極性溶劑化能抵消不了其排斥作用，因而遠離DNJ分子。His332的各項作用力均較小，累計的結(jié)合自由能僅-1.54 kcal/mol。其范德華力和靜電力均為負值，這提示，結(jié)合其帶正電的特性可通過結(jié)構(gòu)修飾、添加羧基一類帶負電或作為氫鍵供體的取代基有利于增強DNJ的結(jié)合力。圖4中DNJ顯示為棍棒模型，酶顯示為飄帶構(gòu)型，所有關鍵氨基酸殘基顯示

為棍棒模型，氫鍵顯示為黃色虛線。

表4 主要殘基的氫鍵分析Table 4 Hydrogen bond analysis of main residues

3 結(jié)論

3.1 經(jīng)過試驗，得出五個與糖尿病相關的蛋白質(zhì)酶分子 PTP1B、PPARα、PPARγ、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶分別與小分子DNJ的分子對接計算的結(jié)果，根據(jù)對接打分和結(jié)合模式分析，初步認為DNJ小分子的作用

3.2 之后再對5種蛋白分別進行了1 ns的分子動力學模擬，采用MM/GBSA方法計算了各體系的結(jié)合自由能。比較發(fā)現(xiàn)，α-葡萄糖苷酶與DNJ的結(jié)合力有絕對優(yōu)勢。因而，推測α-葡萄糖苷酶是DNJ的一個作用靶標。通過延長模擬時間（20 ns）及引入氫鍵分析、聚類分析和能量分解等多種分析方法，從分子水平上精確地闡明了DNJ與α-葡萄糖苷酶的相互作用模式（結(jié)合模式、作用力類型及大?。┡cDNJ降血糖作用的分子機制。

3.3 氫鍵分析和能量分解結(jié)果表明，Asp202、Glu271和Asp333是最主要的關鍵殘基，在DNJ與α-葡萄糖苷酶結(jié)合中有重要作用，其作用方式是形成穩(wěn)定的氫鍵作用，其次為Asn331和His332，通過疏水作用和靜電吸引增強DNJ的結(jié)合力。由于DNJ分子體積小，范德華力和非極性溶劑化能貢獻相對較低，靜電力作用和極性溶劑化能是主要的結(jié)合力來源。DNJ小分子通過與上述關鍵殘基的作用穩(wěn)定結(jié)合在α-葡萄糖苷酶口袋內(nèi)部，從而抑制α-葡萄糖苷酶的生物活性，發(fā)揮降血糖作用。