梁慧潔， 陳尼維， 趙祥運(yùn)， 朱梅影， 伏桂香， 閆厚煜

(1. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院消化內(nèi)科，上海　310000; 2. 廈門市第一醫(yī)院，福建 廈門　361011)

近年來，潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)。有關(guān)活性氧，包括超氧陰離子、過氧化氫、次氯酸、羥自由基和氮等，與炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的相關(guān)性多有報(bào)導(dǎo)。有研究[1]提示硫化氫(H2S)與胰腺炎、膿毒血癥、關(guān)節(jié)炎、慢性阻塞性肺病等炎性疾病密切相關(guān)。宋敏敏等[2]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性H2S能夠有效抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠胰腺纖維化。H2S的抗炎機(jī)制可能與抗氧化、舒展血管、促中性粒細(xì)胞凋亡、降低NF-κB活性、減少白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附有關(guān)。研究[3]發(fā)現(xiàn)，腸壁受損后胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)及3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-MST)表達(dá)顯著增高，且在潰瘍部位更加明顯。本研究以乙酸誘導(dǎo)小鼠UC，探討H2S是否能通過其抗炎抗氧化作用對(duì)UC進(jìn)行保護(hù)并探討可能的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

健康雄性昆明小鼠40只，7～8周齡，體質(zhì)量20～30g，購(gòu)自上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級(jí)： 通風(fēng)良好，20℃恒溫，60%～70%濕度，12h： 12h光照周期。自然光照下分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼以標(biāo)準(zhǔn)普通飼料和水，自由取食和飲水。

乙酸、硫氫化鈉(NaHS)、DL-炔丙基甘氨酸(PAG)、乙酸鋅、對(duì)苯二胺鹽酸鹽、三氯化鐵、三氯乙酸購(gòu)自Sigma公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)生化試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；ELISA試劑盒購(gòu)自Cloud-Clone Corp公司；CSE抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2　小鼠UC模型的建立

昆明小鼠40只，隨機(jī)分為4組： 對(duì)照組、模型組乙酸+NaHS(H2S供體)組、乙酸+PAG(CSE酶的抑制劑)組。采用乙酸UC造模方法對(duì)對(duì)照組以外的3組進(jìn)行造模。昆明小鼠禁食12h后，配制8%乙酸，小鼠麻醉，用硅膠管鈍頭插入小鼠肛門約4cm，抽取8%乙酸0.15mL順硅膠管注入小鼠肛門，速度不宜過快，完成后倒提鼠尾20s，注入1～2mL生理鹽水沖洗，稀釋腸內(nèi)乙酸，常規(guī)飼養(yǎng)，對(duì)照組同樣處理，不加乙酸。灌腸1d后,H2S組每天腹腔注射供體NaHS 50μmol/kg，PAG組每天腹腔注射CSE酶抑制劑PAG 10mg/kg，其余兩組每天腹腔注射等體積生理鹽水溶液。藥物干預(yù)后3d處死小鼠。

1.3　結(jié)腸炎癥程度及造模情況的評(píng)估

自實(shí)驗(yàn)開始即每天記錄小鼠活動(dòng)及進(jìn)食情況以及有無腹瀉、便血、體質(zhì)量減輕,每日留取小鼠糞便進(jìn)行隱血測(cè)定，測(cè)量小鼠造模前及造模后的體質(zhì)量，按Okayasu等[4]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DAI評(píng)分。處死小鼠后觀察腸黏膜外觀,參照Luk等[5]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)腸組織大體評(píng)分，無損傷為0分；黏膜充血但沒有潰瘍?yōu)?分；充血而且腸病變厚但沒有潰瘍?yōu)?分；有一處潰瘍但沒有腸壁增厚為3分；有兩處或兩處以上潰瘍/炎癥為4分；有兩處或兩處以上大潰瘍或有一處潰瘍/炎癥沿結(jié)腸縱軸超過1cm為5分；沿結(jié)腸縱軸損傷超過2cm，每超過1cm加1分，為6～10分。取近肛門端結(jié)腸組織及有潰瘍部位結(jié)腸組織進(jìn)行固定、H-E染色,參照Ekstrom等[6]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)腸組織病理評(píng)分，見表1。

表1　結(jié)腸組織病理評(píng)分表

1.4　血清H2S的測(cè)定

小鼠處死前，麻醉后心臟穿刺采血0.5～1.0mL，注入肝素抗凝真空采血管中,靜置2h后低溫離心(離心半徑16cm，3000r/min，離心10min)，分離血漿。在試管中加入0.5mL 10g/L濃度的醋酸鋅，再加入0.2mL血漿標(biāo)本，震蕩均勻，再依次加入20mmol/L對(duì)氨基二甲基苯胺鹽酸鹽0.5mL、30mmol/L三氯化鐵0.4mL、室溫孵育20min，加入10%三氯乙酸1mL，加入蒸餾水補(bǔ)足體積至5mL。離心半徑16cm，6000r/min，離心5min，吸出上清液，在波長(zhǎng)670nm處用分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度(A670)。根據(jù)H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中H2S的含量。

1.5　ELISA法測(cè)定HO-1、NQO-1

處死小鼠后，取病變組織制備勻漿，離心半徑16cm，3000r/min，離心20min,收集上清液,參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算HO-1、NQO-1含量。

1.6　生化法測(cè)定MDA、SOD、GSH

取病變組織制備勻漿，離心半徑16cm，3000r/min，離心20min,收集上清液,參照MDA、SOD、GSH試劑盒說明書進(jìn)行操作。用分光光度法測(cè)量出MDA、SOD、GSH含量。

1.7　Western印跡法

取病變組織制備勻漿，以裂解液裂解，使用胞漿蛋白提取試劑盒提取胞漿蛋白,BCA法測(cè)蛋白濃度。每孔上樣100μg蛋白,12% SDS-PAGE凝膠電泳分離,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉2h,孵育一抗(CSE抗體),4℃過夜,次日室溫孵育HRP標(biāo)記的二抗(1： 10000稀釋)1h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果,壓片曝光,顯影定影,采用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照,使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.8　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)　　果

2.1　小鼠的一般情況和DAI評(píng)分

對(duì)照組小鼠活動(dòng)、進(jìn)食情況如常，無腹瀉、體質(zhì)量減輕、便血等情況。模型組乙酸灌腸后出現(xiàn)腹瀉、體質(zhì)量減輕、便血等情況。灌腸后3d，上述癥狀達(dá)高峰。PAG組上述癥狀相較于模型組及NaHS組重，而NaHS組較模型組減輕。模型組、NaHS組、PAG組DAI評(píng)分均高于對(duì)照組(P<0.05)，PAG組高于模型組、NaHS組(P<0.05)，NaHS組較模型組較低(P<0.05)，見表2。

2.2　大體和病理損傷評(píng)分

肉眼觀察，對(duì)照組小鼠結(jié)腸大體標(biāo)本無水腫、糜爛和潰瘍的形成，模型組、NaHS組及PAG組均可見黏膜充血水腫糜爛及潰瘍形成，但NaHS組病變程度輕于模型組，PAG組較模型組、NaHS組重，見表2。組織病理切片顯示，除對(duì)照組外，其他3組病變結(jié)腸黏膜均出現(xiàn)不同程度的水腫、出血、潰瘍、隱窩消失、偽膜形成,各層均有淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),病變呈連續(xù)性，病理損傷評(píng)分均高于對(duì)照組(P<0.05)，PAG組高于模型組及NaHS組(P<0.05)，NAHS組則低于模型組(P<0.05)，見表2、圖1。

表2　疾病活動(dòng)度及炎癥程度評(píng)分Tab.2　Disease activity index and inflammation score

與對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與NaHS組相比，cP<0.05

圖1　各組小鼠結(jié)腸組織H-E染色Fig.1　Colonic tissue H-E staining in mice of each group

2.3　血清H2S含量比較

模型組、NaHS組血漿H2S含量高于正常對(duì)照組(P<0.05),PAG組低于NaHS組和模型組，NAHS組高于模型組及對(duì)照組(P<0.05)，見表3。

2.4　結(jié)腸組織HO-1、NQO-1含量

模型組、PAG組、NAHS組結(jié)腸組織HO-1含量低于正常對(duì)照組(P<0.05)，NaHS組高于模型組(P<0.05)，PAG組低于模型組及NaHS組(P<0.05)。模型組、PAG組、NAHS組結(jié)腸組織NQO-1含量低于正常對(duì)照組(P<0.05),NaHS組高于模型組(P<0.05)，PAG組低于NAHS組(P<0.05),見表3。

2.5　結(jié)腸組織MDA、SOD、GSH含量

模型組結(jié)腸組織MDA含量高于對(duì)照組(P<0.05)，而NaHS組低于模型組(P<0.05)，PAG組高于對(duì)照組及NaHS組(P<0.05)。模型組、PAG組(P<0.05)、NAHS組結(jié)腸組織SOD活力、GSH含量相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05),NAHS組高于模型組(P<0.05)，PAG組低于模型組及NAHS組(P<0.05)，見表4。

表3　各組血清H2S含量,結(jié)腸組織HO-1、NQO-1含量Tab.3　The levels of H2S in serum and the levels of HO-1、NQO-1 in colonic tissue of each groups

與對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與NaHS組相比，cP<0.05

表4　各組結(jié)腸組織MDA、GSH含量、SOD活力Tab.4　The levels of MDA、GSH and the activity of SODin colonic tissue of each groups

與對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與NaHS組相比，cP<0.05

2.6　Western印跡法結(jié)果

模型組CSE量較其他3組升高(P<0.05)，PAG組CSE量較NaHS及模型組降低(P<0.05)，NAHS組CSE量較模型組降低(P<0.05)，見圖2。對(duì)照組、模型組、NAHS組和PAG組CSE/GAPDH量分別為0.60±0.04、0.86±0.18、0.44±0.25、0.28±0.10。

圖2　各組結(jié)腸CSE蛋白表達(dá)水平Fig.2　The levels of CSE protein expression in the colon homogenates

3　討　　論

近年來，研究[7]表明氧自由基和抗氧化酶失衡所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激與UC密切相關(guān)。研究[8]顯示，自發(fā)性UC實(shí)驗(yàn)犬血清ROS較健康對(duì)照組升高。乙酸UC模型的致病機(jī)制、組織病理學(xué)特征及炎性介質(zhì)與人類IBD相似，均存在顯著的氧化物與抗氧化物失衡[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組，模型組結(jié)腸MDA含量升高，且HO-1、NQO-1含量及MDA、SOD、GSH活性降低。以往研究[10]發(fā)現(xiàn)乙酸UC小鼠血清抗化酶活性(SOD、GSH)降低，氧化損傷標(biāo)志物MDA含量升高，與本研究結(jié)果相似。綜上所述，UC的黏膜損傷機(jī)制可能與過氧化物的增多及抗氧化酶活性的下降呈正相關(guān)。

H2S的抗炎的作用已被逐漸認(rèn)識(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，NaHS組DAI、大體及病理損傷評(píng)分均低于模型組，并且PAG組評(píng)分均高于模型組，這表明H2S對(duì)UC具有保護(hù)作用。研究[11]顯示，H2S對(duì)UC具有治療作用，并認(rèn)為其機(jī)制可能與上調(diào)CSE的表達(dá)并提高隨后的H2S釋放有關(guān)，這與本研究一致。研究[12]用H2S干預(yù)UC小鼠，發(fā)現(xiàn)H2S可減輕腸黏膜損傷，并能降低結(jié)腸組織IL-4含量。研究[13]顯示，上調(diào)乙酸UC小鼠結(jié)腸組織中的GSH、SOD等抗氧化酶的表達(dá)可降低腸黏膜損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，NaHS組HO-1、NQO-1含量及MDA、SOD、GSH活性升高，并且氧化標(biāo)志物MDA含量降低，抑制H2S的產(chǎn)生后則相反，由此推斷H2S的保護(hù)作用與對(duì)抗氧化酶的激活密切相關(guān)。

本研究通過乙酸誘導(dǎo)小鼠UC模型發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性H2S能有效減輕腸黏膜損傷，其中的機(jī)制可能與上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)有關(guān)。小鼠乙酸UC模型雖能模擬人類UC，但具體機(jī)制并不完全一致，因此H2S能否作為一種抗氧化劑進(jìn)入臨床用于治療UC還需進(jìn)一步研究。